江苏部分地区牛群肠出血性大肠杆菌分离株分子流行病学及EHEC O157：H7鞭毛蛋白单克隆抗体的研制

论文摘要

产志贺氏毒素大肠杆菌（shiga toxin-producing E. coli, STEC）是一群重要的肠道致病菌。目前至少有100多种血清型的大肠杆菌具有产志贺氏毒素的能力,其中血清型为O157:H7的菌株具较高致病力。通常将人类感染病例中分离的具有pO157质粒、产生AE损伤（attaching and effacing lesion）的STEC菌株统称为肠出血性大肠杆菌（entero-hemorrhagic E. coli, EHEC）。EHEC主要包括O157:H7,O26:H11和O111等几种血清型,其中O157:H7作为典型菌株,主要通过食物传播,健康家畜,特别是反刍动物如牛、羊等被视作为该菌的天然带菌动物。该类细菌能够引起人类腹泻,出血性结肠炎（haemorrhagic colitis, HC）,溶血性尿毒综合征（haemolytic uraemic syndrome, HUS）,血栓性血小板减少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP）等,严重者可导致死亡。鉴于EHEC对人类的高致病性,对该类细菌在自然界的流行特征、生物学特性、致病因子、感染机理及防治等各方面的深入研究显得愈发重要。现今,通过分子生物学、免疫学等手段实现EHEC的快速临床检测,是防止人类发生EHEC感染的重要途径之一。通过对毒力因子的深入研究,将促进新的检测、诊断方法的开发,为控制EHEC的流行提供有力手段;与此同时,将在进出口检验和公共卫生方面具有一定的应用前景。1. EHEC多重PCR检测方法的建立及其分子流行病学本研究基于EHEC O157:H7 EDL933W株的stx1、stx2、eaeA、hlyA四个基因建立了多重PCR检测方法。并运用该多重PCR体系配合选择性增菌、分离培养等检测手段,初步了解EHEC O157、O26、O111以及其他血清型的STEC大肠杆菌在牛群的带菌和流行情况。研究期间共采集动物粪便等样品共计1128份,最终获得分离株共计74株,分离率为6.56%。所获得菌株的毒力相关基因的携带表现出一定的多态性,其中属于STEC的为30株,占分离株总数的40.54%。经过血清学鉴定其中典型的EHEC血清型有O26和O157,分离菌株数分别是23株和2株,各占已定型菌株的34.33%和2.99%,分别占采集样品总数的2.04%和0.18%。结果表明,在牛群中非O157血清型的EHEC菌株如O26等所占的比例更高。由此提示,牛粪可能是食品中EHEC污染的来源,因此控制大肠杆菌EHEC在牛场环境中的存活与扩散,加强牛肉及其制品以及牛奶中该类细菌的检测,是防止人类发生EHEC感染的重要途径之一。2. EHEC感染ICR小鼠动物模型的建立本实验通过萘啶酮酸（nalidixic acid, Nal）饮水、丝裂霉素（mitomycin, MMC）腹腔注射并结合小鼠体内传代的方法初步建立了EHEC感染的ICR小鼠模型,复制出了人类感染EHEC所出现的部分临床症状和主要病理变化。证实以109 CFU的EHEC灌服感染小鼠,可致半数及以上的3周龄ICR小鼠死亡,确定了小鼠的感染剂量,并初步掌握了各受试分离株的致病力;同时,本实验对感染小鼠的粪便排菌情况及细菌在各脏器的分布情况进行了分析,结果表明感染小鼠的排菌时间均在14 d以上,粪便中细菌平均含量达104 CFU/g以上;实验组各受检脏器的活菌分布基本一致,但以盲、结肠最多,可达107 CFU/g以上。该动物模型的成功建立对探索此类细菌的感染机制、毒力因子的致病作用有重要意义,并为其疫苗侯选株安全性的评价打下基础。3. EHEC O157:H7鞭毛蛋白单克隆抗体的研制本研究以EHEC O157:H7的灭活全菌与粗提的鞭毛蛋白作为免疫原,利用细胞融合技术获得了10株分泌抗EHEC O157:H7单克隆抗体（monoclonal antibodies, MAbs）的杂交瘤细胞株,用间接ELISA法测定其免疫球蛋白亚类,并结合ELISA法、凝集法和Western blot鉴定单抗的特异性。结果显示,其中6株仅与血清型为O157的大肠杆菌参考株和分离株反应,与其他受试菌株均不反应。结合ELISA效价与直接凝集价,杂交瘤细胞株7E2、4E2、1D7的效价最高,特异性较强。由粗提鞭毛蛋白作为免疫原的1株单抗1A6仅与EHEC O157:H7菌株及同样表达H7鞭毛的O26血清型的STEC H8反应,与血清型为O157的非EHEC E. coli不发生反应;经ELISA与Western blot鉴定该株的抗原结合位点是鞭毛蛋白抗原。鉴于该株单抗较高的特异性,在制备检测EHEC O157:H7的病原检测试剂上具有一定的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 1 EHEC 的毒力因子及致病机理
• 2 EHEC 的检测方法
• 3 EHEC 感染的流行病学与防控
• 4 结语
• 参考文献
• 第一章 EHEC 多重PCR 检测方法的建立及其分子流行病学
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二章 EHEC 感染ICR 小鼠动物模型的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 EHEC O157:H7 鞭毛蛋白单克隆抗体的研制
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 致谢