转基因油菜衰老特异性表达病程相关基因CH5B和HvOxOh的研究

论文摘要

油菜是世界上重要的油料作物之一,是食用油的重要来源。菌核病是油菜中很流行的腐生性病害,它由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）感染所致,它主要在油菜生长的成熟期发作,严重影响油菜的产量和品质。已有的研究表明,目前暂没有发现抗菌核病的油菜品种,品种之间只有耐性的不同,油菜本身没有抗性的资源,这一局限成为了油菜抗菌核病育种的瓶颈。然而,转基因技术为油菜抗病育种带来了新的契机。针对油菜菌核病的发病特点,本研究采用了在油菜中衰老特异表达病程相关基因—几丁质酶编码基因CH5B和大麦草酸氧化酶HvOxOh,来提高油菜的抗病性。表达载体SAG12:CH5B、SAG12:HvOxOh和35S:CH5B被用来转化甘蓝型油菜品种Westar10,本实验研究了转化过程中影响转化的限制性因素,包括外植体苗龄大小、共培养时间、激素浓度和抗生素浓度。研究表明:4d苗龄的外植体最适合转化;共培养2d时间较为合适;4mg/L的6-BAP影响外植体的分化;500mg/L的羧苄青霉素限制外植体的生长。分别得到了13株转化SAG12:CH5B、5株转化SAG12:HvOxOh和14株转化35S:CH5B的转基因植株。对部分转基因植株进行了Southern杂交分析,结果证明外源基因已经插入到了转基因植株基因组中。RT-PCR和Northern杂交分析了外源基因在RNA水平上的表达,证实了外源基因在转化SAG12:CH5B和SAG12:HvOxOh的转基因植株中衰老时期特异表达。对几丁质酶活性和草酸氧化酶活性的分析结果表明外源基因的表达产物具有活性,同时具有在衰老时期特异表达的特性。对3种不同类型的转基因植株离体叶片进行了菌核病接种,接种受体分别为转化SAG12:CH5B和SAG12:HvOxOh的转基因植株的下部衰老叶片,转化35S:CH5B的转基因植株的幼嫩叶片,结果表明转基因植株在目前的接种胁迫条件下没有明显表现出对核盘菌抗性的增强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 油菜菌核病研究
• 1.2 转基因技术研究进展
• 1.2.1 转基因技术在生产中的应用
• 1.2.2 In planta转化
• 1.3 抗病基因资源
• 1.3.1 抗病基因
• 1.3.2 植物防卫基因
• 1.3.2.1 几丁质酶
• 1.3.2.2 草酸氧化酶
• 1.3.2.3 抗病协同作用
• 1.4 拟南芥衰老特异性启动子SAG12
• 1.5 油菜转基因技术
• 1.6 菌核病接种方法
• 1.6.1 牙签活体接种法
• 1.6.2 子囊孢子喷雾法
• 1.6.3 菌丝体块接种
• 1.6.4 菌丝体悬浮液法
• 1.6.5 草酸毒素法
• 1.6.6 离体叶片接种法
• 2 研究目的和意义
• 2.1 研究目的
• 2.2 研究意义
• 3 材料和方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 转化载体
• 3.1.3 实验试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 载体构建
• 3.2.1.1 载体35S:CH5B的构建
• 3.2.1.2 载体SAG12:CH5B的构建
• 3.2.1.3 载体SAG12:HvOxOh的构建
• 3.2.2 农杆菌介导的油菜遗传转化
• 3.2.2.1 农杆菌的培养
• 3.2.2.2 外植体的获得
• 3.2.2.3 预培养
• 3.2.2.4 共培养
• 3.2.2.5 分化筛选培养
• 3.2.2.6 生根培养与移栽
• 3.2.3 转基因植株的分子鉴定
• 3.2.3.1 PCR鉴定
• 3.2.3.2 Southern杂交
• 3.2.3.3 RT-PCR检测
• 3.2.4 几丁质酶活性测定
• 3.2.4.1 胶体几丁质的制备
• 3.2.4.2 活性测定
• 3.2.5 蛋白质浓度的测定
• 3.2.6 草酸氧化酶活性的测定
• 3.2.7 菌核病抗性试验
• 4 结果和分析
• 4.1 苗龄对愈伤诱导的影响
• 4.2 共培养时间的确立
• 4.3 6-BAP对外植体的影响
• 4.4 CB浓度对芽伸长和生根的影响
• 4.5 分子鉴定结果
• 4.5.1 PCR扩增
• 4.5.2 Southern杂交
• 4.5.3 RT-PCR检测
• 4.5.4 Northern杂交
• 4.6 几丁质酶活性
• 4.7 草酸氧化酶活性
• 4.8 核盘菌接种
• 5 讨论
• 5.1 油菜转基因技术
• 5.1.2 共培养时间
• 5.1.3 激素浓度
• 5.1.4 抗生素浓度
• 5.1.5 转化效率
• 5.2 SAG12启动子
• 5.3 外源基因与抗病性
• 6 展望
• 图版
• 图版说明
• 参考文献
• 致谢