论文摘要
链霉菌通过自身的次级代谢能够产生许多重要的天然复合物,特别是能够合成具有生物活性的抗生素。目前,与抗生素生物合成相关的基因功能的研究主要是通过基因打靶载体的同源重组手段来实现的。本研究中,我们设计了一种快速高效的构建基因打靶载体的方法。该方法是建立在链霉菌噬菌体φBT1整合酶系统的基础上,通过多位点间的一步特异性重组反应来完成的。这种方法省时高效,能够快速的完成靶标基因的替换。另外,由于预先在抗性筛选标记的两端设计了φC31整合酶的识别位点attB0-φC31和attP0-φC31,靶基因被成功置换后,通过φC31整合酶所催化的体内位点特异性重组反应可以进一步精确的切离留在染色体基因组上的抗性基因,从而实现对基因组的多次修饰。我们将这个方法成功应用到了天蓝色链霉菌的基因组改造中,对S.coelicolor M145的CDA和Act生物合成基因簇的部分基因进行了敲除,阻断了CDA和Act的合成。在此基础上,我们又敲除了负调控Red合成的rdA基因,从而得到了Red过产菌株ZB8,使得突变株中Red的产量比野生型菌株提高了5倍多。位点特异性重组技术在基因打靶载体的构建和染色体抗性标记的移除应用中体现了巨大的潜能。不仅如此,本研究中我们还展示了位点特异性重组技术的新的应用策略,将φBT1整合酶系统成功应用到了抗生素生物合成基因簇的克隆操作中。我们将φBT1整合酶的识别位点attB和attP通过同源重组的方式插入到红霉素生物合成基因簇的两侧,再经过φBT1整合酶催化的位点特异性重组反应完成attB和attP两位点间序列的包装,用这种方法我们成功实现了长达55kb的红霉素生物合成基因簇的体外克隆,并将基因簇在天蓝色链霉菌工程菌株和其它宿主菌株中进行了异源表达。通过初步的质谱分析,我们检测到了新的复合物的生成。总之,我们的方法为链霉菌基因组的遗传操作提供了新的手段,为功能基因的鉴定提供了新的机遇。
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标签：天蓝色链霉菌论文; 位点特异性重组论文; 基因打靶论文; 生物合成基因簇异源表达论文;