论文摘要
尽管治疗急性心肌梗死的方法有了很大的进展,但是治疗心肌梗死后由于心室重构导致的慢性充血性心力衰竭的效果是有限的。如今,间充质干细胞（MSCs）移植在治疗心肌梗死中展现出良好的前景,已经有很多研究显示MSCs移植可以通过干细胞重塑提高心脏结构和功能的修复。移植后MSCs除了少部分可能向心肌细胞分化而代替死亡的心肌细胞外,它还能通过旁分泌来分泌许多生长因子与细胞因子,这些因子对周围细胞发挥有益的作用,从而对心脏功能的提高起重要作用。然而,移植的MSCs因受心脏中不利环境的影响,特别是在缺血的条件下,移植进梗死心脏中4天内,大部分移植的MSCs死亡,这就限制了MSCs的移植效果。因此对MSCs的细胞保护,减少移植后MSCs的死亡,对成功的细胞治疗非常重要。Neuregulins（简称NRG）是和表皮生长因子相关的生长和分化因子家族,NRG的受体为ErbB酪氨酸激酶跨膜受体家族,包括ErbB2、ErbB3和ErbB4受体。不同拼接的NRG1基因导致翻译3个主要的蛋白,Ⅰ型NRG1又叫heregulin（简称HRG）,是一个44kD的糖蛋白,主要表达在神经组织、呼吸系统上皮和心内膜。通过激活ErbB受体,HRG能提高上皮细胞、神经元、神经胶质细胞、心肌细胞以及其他类型细胞的生存。HRG也能诱导VEGF的表达和刺激血管形成。本实验的目的为检测HRG/ErbB系统是否在MSCs中表达,以及HRG是否有增加MSCs存活的作用。第一步我们检测了MSCs中ErbB受体和HRG的表达,因为在MSCs移植中,干细胞要经受缺血的环境,所以我们也检测了HRG和ErbB受体在缺氧缺血清环境下表达的变化。检测到MSCs有ErbB受体表达后,我们用缺氧缺血清模型诱导MSCs的凋亡,其中缺氧和缺血清是体内缺血的两个主要成分,然后检测了HRG对MSCs凋亡的影响。第一部分Heregulin和ErbB受体在间充质干细胞中的表达方法:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法从雄性SD大鼠骨髓中分离出MSCs,然后进行培养,取传代后第3代细胞进行细胞形态学和流式细胞学鉴定,所有实验都用第3代细胞。用普通逆转录PCR、实时定量逆转录PCR、免疫荧光检查和Western Blot方法检测正常以及缺氧缺血清情况下ErbB受体和HRG的表达,为了检测MSCs是否分泌HRG,我们收集和浓缩MSCs的培养基,然后做Western Blot检查。结果:1.MSCs的形态和鉴定MSCs分离培养到了第3代后就较纯,显微镜下几乎见不到杂质细胞,进行细胞表面标记鉴定发现大多数细胞表达粘附分子CD44和CD90,而很少细胞表达造血细胞表面标记CD45,这结果符合MSCs的特征。2.ErbB受体在MSCs中的表达用普通逆转录PCR和实时定量逆转录PCR方法都发现3个ErbB受体mRNA在MSCs中均有表达,但ErbB2受体表达强于ErbB3,ErbB3受体表达强于ErbB4。缺氧缺血清使ErbB2、ErbB3及ErbB4这3个受体表达都明显下调。用免疫荧光检查ErbB4受体的表达,结果表明MSCs在蛋白水平有ErbB4受体表达,但表达较低。3.HRG的表达和分泌HRG无论在mRNA还是在蛋白水平均有表达,缺氧缺血清能增加HRG的表达,缺氧缺血清12小时以上能激活HRG的分泌。第二部分Heregulin减少间充质干细胞缺氧缺血清诱导的凋亡方法:细胞用DMEM培养液冲洗两次,然后再加入DMEM培养液,继而根据实验需要分别加入Tyrphostin AG1478（ErbB3/4阻滞剂）10uM、AG825（ErbB2阻滞剂）10uM、Wortmannin（PI3K阻滞剂）0.2uM和HRG因子（5-100ng/mL）。加入试剂1小时后,细胞放入一缺氧罐中,然后充入95%N2和5%CO2的混合气体,使里面的氧气浓度＜0.5%,再放入37℃培养箱中培养到实验要求的时间终点。用TUNEL和Hoechst染色检测各组细胞凋亡率,用Western blot法检测各组的PI3K/Akt和MAPK（ERK、JNK、P38）信号通路及凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3的变化。结果:1.HRG减少缺氧缺血清诱导MSCs的凋亡我们选择缺氧缺血清12小时和18小时诱导MSCs凋亡,结果发现与对照组比较,缺氧缺血清显著增加MSCs的凋亡,在18小时（22.96±0.97%比2.89±0.62%,P＜0.01）,在12小时（14.41±1.61%比2.89±0.62%,P＜0.01）。我们检测了不同浓度HRG对缺氧缺血清18小时诱导MSCs凋亡的效果,发现HRG能减少缺氧缺血清诱导的凋亡,抗凋亡效果从10-50ng/ml呈剂量依赖型,浓度为50ng/ml时能达到最大的抗凋亡效果。HRG对凋亡的减少程度在缺氧缺血清18小时和12小时是相似的,在18小时,一个显著的减少从22.96±0.97%到12.85±0.91%（P＜0.01）,在12小时,一个显著的减少从14.41±1.61%到8.59±0.54%（P＜0.01）。AG1478和AG825能阻断HRG的抗凋亡效果。2.HRG诱导AKT和ERK的磷酸化缺氧缺血清显著性地抑制Akt（Ser473）的磷酸化,显著性地激活ERK（Tyr204）的磷酸化（P＜0.01）。HRG显著性地增加Akt和ERK的磷酸化,但加入阻滞剂AG1478或者AG825时,这些效果消失了。然而JNK（Thr183/Tyr185）和p38（Thr180/Tyr182）的磷酸化不受缺氧缺血清和HRG的影响。3.HRG增加Bcl-2/Bax比率和减少caspase3的激活缺氧缺血清能显著性减少Bcl-2/Bax的比率（P＜0.01）及显著性地激活caspase3（p＜0.01）。但加入HRG后能显著性增加Bcl-2/Bax的比率（P＜0.01）及显著性地抑制缺氧缺血清诱导的caspase3的激活（P＜0.01）。Wortmannin能阻断HRG的这些效果,提示PI3K/Akt通路在HRG减少缺氧缺血清诱导MSCs凋亡的作用上起着重要的作用。结论:MSCs能表达heregulin和ErbB2、ErbB3、ErbB4受体。缺氧缺血清显著性地下调3个ErbB受体的mRNA表达、增加HRG的表达以及激活HRG的分泌。通过激活PI3K/Akt和ERK细胞信号通路、Bcl-2/Bax比率的增加和抑制caspase3的激活,HRG能减少缺氧缺血清诱导的MSCs的凋亡。