基于单链抗体的甲胺磷残留ELISA检测方法的建立及初步应用

论文摘要

作为一种广谱高效的有机磷杀虫剂,甲胺磷（methamidophos,MTP）被广泛应用于水稻、棉花和蔬菜等农作物害虫的防治,但同时甲胺磷又是一种剧毒农药,易被植物吸收,易随流水迁移和扩散,这在很大程度上对农业生产与农村环境安全造成不利影响。因此,甲胺磷的残留检测,尤其是农药残留速测技术的研究在建立公众食品安全保障体系中具有现实意义。本研究以甲胺磷为对象,利用甲胺磷噬菌体单链抗体库筛选到的阳性克隆28D4菌株制备了特异性识别甲胺磷的scFv抗体,建立了甲胺磷间接竞争ELISA方法,并用该ELISA方法测定了大田稻谷和小白菜样品中的甲胺磷残留量。一、抗甲胺磷单链抗体表达条件的优化及性质鉴定以抗甲胺磷噬菌体单链抗体库筛选到的阳性克隆28D4为研究对象进行了抗甲胺磷单链抗体表达条件的优化试验及性质鉴定。结果显示,优化后的表达条件为:诱导温度30℃,IPTG终浓度0.25mM,诱导时间20 h;在优化表达条件下,单链抗体的表达量约0.95mg/L培养基,比没有优化条件下的产量提高近0.2mg/L;该抗体的亲和常数为（3.14±0.99）×107L/mol;该抗体与乙酰甲胺磷的交叉反应率为3.0%,与其它八个有机磷农药的交叉反应率均小于0.1%。二、甲胺磷间接竞争ELISA检测方法的建立以上述HM3-OVA以及scFv抗体建立了甲胺磷的检测曲线,同时还确立了该检测曲线的工作条件和基本参数,并进一步对该检测方法进行了准确度和精确度方面的评价。甲胺磷ELISA检测曲线的最佳检测条件为:包被抗原（HM3-OVA）0.5μg/mL（稀释倍数为1:20000）,抗体稀释度为1:320,最佳封闭物为3%脱脂奶粉,抗原抗体反应体系中氯化钠的离子强度为0.05 mol/L,最适PH值为6.5。在上述条件下,通过间接竞争ELISA程序得到一条竞争曲线,甲胺磷在1～500μg/mL范围内,Logit（B/Bo）与甲胺磷浓度的对数值呈显著的线性关系。以[Logit（B/B0）]作纵坐标（Y）,甲胺磷浓度（μg/mL）对数值作横坐标（X）,得线性回归方程Y=-1.0116X+2.0421,其相关系数R2=0.9669,IC50=104.4μg/mL;检出限IC20为4.45μg/mL。在该线性范围内,标准曲线的批内批间变异系数分别为2.1%和7.0%。水、稻谷和小白菜样品中甲胺磷的平均回收率分别为108.7%、89.8%和93.2%,且三个样品各自的添加曲线与所建立的标准曲线平行。三、甲胺磷间接竞争ELIsA检测方法的初步应用2006年,采集江苏各地大田稻谷12份,安徽大田稻谷1份。ELISA检测为阳性的样品为8份,占样品总数的61.5%;阳性样品中甲胺磷的残留量为0.17～0.83mg/kg,8个阳性样品的平均残留量为0.41±0.23mg/kg。2006年12月,于南京东郊露地菜地和菜场采集的17份小白菜样品中,ELISA检测为阳性的样品1份,该阳性样品为市场上采集,其甲胺磷残留量仅为0.395±0.013mg/kg。同时进行的GC分析结果表明,同一样品用ELISA检测获得的结果与GC分析得到的结果呈显著的线性关系,ELISA值=1.0443×GC值-0.007,n=9,相关系数r=0.9986。甲胺磷在小白菜中的残留和消解动态试验表明,冬季露地小白菜上甲胺磷的残留动态方程为Y=0.56462e-0.113T,相关系数r=-0.9931,降解速率常数k为0.113,半衰期为6.13d。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 农药残留及其检测方法
• 1.农药残留现状和危害
• 1.1 我国的农药残留现状
• 1.2 农药残留的危害
• 1.3 农药残留形成的原因
• 2.农药残留分析方法
• 2.1 仪器分析法
• 2.2 化学分析法
• 2.3 生物分析法
• 2.4 免疫分析法
• 3.甲胺磷残留及其检测方法研究进展
• 4.展望
• 第二章 单链抗体在大肠杆菌中的分泌性表达
• 1.scFv在E.coli中分泌性表达的原理
• 2.影响scFv在E.coil周质腔中分泌性表达的因素
• 2.1 启动子、信号肽、scFv中的接头
• 2.2 成熟scFv的一级结构
• 2.3 宿主菌
• 2.4 scFv的诱导表达条件
• 2.5 共表达分子伴侣
• 3.影响scFv分泌至E.coli胞外的因素
• 3.1 培养温度及IPTG的浓度
• 3.2 加入改变细胞膜通透性及渗透压的化学物质
• 3.3 采用渗漏型的菌株
• 3.4 scFv直接分泌到培养基中
• 4.小结
• 下篇 研究内容
• 第一章 抗甲胺磷单链抗体细菌表达条件的优化及性质鉴定
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株及阳性噬菌体单链抗体克隆
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基及溶液
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 包被抗原HM3-OVA的制备
• 1.2.2 包被抗原的紫外可见光谱鉴定
• 1.2.3 对数生长期E.coli HB2151的制备
• 1.2.4 阳性克隆重组噬菌体的制备
• 1.2.5 阳性克隆噬菌体对E.coli HB2151的感染
• 1.2.6 可溶性抗甲胺磷单链抗体的初步表达
• 1.2.7 可溶性抗甲胺磷单链抗体表达条件的优化
• 1.2.8 可溶性单链抗体的大量制备
• 1.2.9 可溶性单链抗体的纯化
• 1.2.10 间接ELISA分析程序
• 1.2.11 纯化抗体的效价测定
• 1.2.12 抗体亲和常数的测定
• 1.2.13 抗体的特异性测定
• 2.结果与分析
• 2.1 甲胺磷人工抗原的合成与鉴定
• 2.2 阳性克隆噬菌体对E.coli HB2151的感染
• 2.3 可溶性抗甲胺磷单链抗体表达条件的优化
• 2.3.1 诱导温度的优化
• 2.3.2 诱导时间的优化
• 2.3.3 诱导剂浓度的优化
• 2.4 可溶性单链抗体的大量制备和纯化
• 2.5 纯化抗体的效价
• 2.6 抗体的亲和常数测定
• 2.7 抗体的特异性
• 3.讨论
• 第二章 甲胺磷间接竞争ELISA检测方法的建立
• 1.材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3方法
• 1.3.1 间接ELISA分析程序
• 1.3.2间接竞争ELISA分析程序
• 1.3.3 间接竞争ELISA最佳工作条件的确定
• 1.3.4 ELISA标准曲线的建立及灵敏度评价
• 1.3.5 精确度试验
• 1.3.6 准确度试验
• 2.结果与分析
• 2.1 甲胺磷竞争ELISA最佳工作条件的确定
• 2.1.1 抗原抗体工作浓度的确定
• 2.1.2 盐离子强度对竞争ELISA检测结果的影响
• 2.1.3 不同封闭物对竞争ELISA检测结果的影响
• 2.1.4 不同pH值对竞争ELISA检测结果的影响
• 2.2 ELISA标准曲线的建立及灵敏度评价
• 2.3 精确度分析
• 2.4 准确度分析
• 3.讨论
• 第三章 甲胺磷间接竞争ELISA方法的初步应用
• 1.材料与方法
• 1.1 主要试剂和仪器设备
• 1.1.1 仪器
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 大田试样
• 1.2 样品中甲胺磷残留量的测定
• 1.2.1 GC分析
• 1.2.2 ELISA测定
• 1.3 甲胺磷在小白菜中的残留和消解动态
• 2.结果与分析
• 2.1 样品中甲胺磷残留量的测定
• 2.2 小白菜中甲胺磷的消解动态
• 3.讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢