降低烟草亚硝胺目的菌的筛选及应用研究

论文摘要

烟草特有亚硝胺（TSNA）是只存在于烟草及其相关制品和烟气中的一类有害物质,其合成的前体物质为烟草生物碱、硝酸盐和亚硝酸盐。烟叶中亚硝酸盐的积累是影响TSNA积累的关键因素。目前,利用生物技术降低TSNA日渐成为研究热点,高效反硝化细菌（Denitrifying Bacteria）能够将硝酸盐还原为亚硝酸盐后,进一步还原为气体,从而降低TSNA含量。本课题以烤烟上部烟叶为研究对象,利用微生物降低烟草特有亚硝胺（TSNA）的前体物质——硝酸盐和亚硝酸盐的含量来达到最终降低TSNA的目的。从烟叶、土壤中富集、分离、纯化,得出25株初筛反硝化细菌,进一步通过Giltay法定量检测其反硝化能力进行复筛。其中,接种T1-2、T2-2菌株的试管产气早,变色快,4 d-5 d产气达到高峰,表明反硝化能力最强,考察10 d-14 d后Giltay培养基中氮素分布情况,发现接种T1-2、T2-2试管中硝酸盐降低率分别为100%和95.30%,亚硝酸盐含量稍有增加,但脱氮率分别为99.00%和88.78%。通过16S rDNA比对和生理生化特性分析,菌株T1-2和T2-2均被鉴定为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。考察了恶臭假单胞菌T1-2、T2-2陈化上部烟叶工艺及其降低TSNA的效果。将恶臭假单胞菌T1-2、T2-2的发酵液制备成108 CFU/mL的菌悬液,直接喷洒在上部烤烟烟叶表面,喷洒用量为烟叶质量的10%,以烟叶喷洒后手捏不成团为宜,于光照培养箱中陈化；陈化条件为处理温度28℃、相对湿度45%,陈化时间21天。结果表明,与对照相比,接种后烟叶中硝酸盐、亚硝酸盐含量均有所降低,14 d时,硝酸盐降低率最高,接种T1-2、T2-2烟叶中亚硝酸盐降低率分别达到2.25%和8.05%；21d时,亚硝酸盐降低率最高,分别达到19.90%和20.99%,同时TSNA中的关键组分N-亚硝基去甲基烟碱（NNN）和4-（N-甲基-亚硝基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）的降低率最高,与对照相比,接种T1-2的烟叶,其NNN和NNK含量分别下降了56.48%和-21.36%（P<0.05）,接种T2-2的烟叶,其NNN和NNK含量分别下降了28.33%和57.83%（P<0.05）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 烟草特有亚硝胺概述
• 1.2 TSNA的形成机制
• 1.3 影响烟草特有亚硝胺（TSNA）积累的主要因素
• 1.3.1 良种选育与TSNA
• 1.3.2 栽培技术与TSNA
• 1.3.3 烟叶调制与TSNA
• 1.4 反硝化细菌在降低TSNA的应用
• 1.4.1 反硝化细菌种类
• 1.4.2 反硝化细菌作用机制
• 1.5 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 烟叶和土壤来源
• 2.1.2 培养基及制备
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 PCR扩增引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 反硝化细菌的富集、分离、纯化
• 2.2.2 反硝化细菌的复筛
• 2.2.3 反硝化细菌的鉴定
• 2.2.4 菌悬液的制备
• 2.2.5 上部烤烟的人工陈化
• 2.2.6 烟叶TSNA的测定
• 2.2.7 烟叶中硝酸盐、亚硝酸盐的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 反硝化细菌的分离筛选及鉴定
• 3.1.1 反硝化细菌分离及反硝化能力测定筛选
• 3.1.2 反硝化细菌T1-2和T2-2的鉴定
• 3.2 恶臭假单胞菌对上部烤烟TSNA降低效果研究
• 3.2.1 陈化时间优化
• 3.2.2 菌悬液浓度的优化
• 3.2.3 陈化后烟叶TSNA检测
• 3.2.4 恶臭假单胞菌人工陈化烟叶评吸结果
• 4. 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.2 讨论
• 参考文献
• 研究生期间科研成果
• 致谢