论文摘要
固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles,SLN）是继乳剂、脂质体、微粒和毫微粒后近年来研究十分活跃的靶向控释胶粒给药系统。SLN在室温下通常呈现固态,具有聚合物纳米粒物理稳定性高、药物泄漏少的优势,又兼有脂质体、乳剂的毒性低优点,是一种潜在的新型给药系统。作为一种新型给药系统,SLN具有广阔的发展前景,但是,SLN也存在一些潜在的局限性,如有限的载药能力、储存过程的药物排挤现象等问题。纳米结构脂质载体（nanostructured lipidcarrier,NLC）是新一代的脂质纳米粒。NLC由几种熔点不同的固液脂质混合物作为基质。液体脂质的加入,可扰乱固体脂质规则的品格结构,增加纳米粒结构中不规则晶型的比例,使承载脂溶性药物的空间容量增加,从而提高载体的载药能力。通过控制液体脂质比例,还可使NLC在体温下保持固体骨架结构,实现NLC药物的控制释放。本研究以异硫氰基荧光素的异硫氰基与硬脂胺的氨基的偶合反应制备得到的硬脂胺-异硫氰基荧光素（octadecylamine-fluorescein isothiocyanate,ODA-FITC）为荧光标记物,通过溶剂扩散法制备荧光标记脂质纳米载体。以A549肺癌细胞为模型细胞,考察不同脂质纳米载体的细胞转运。研究表明,A549细胞摄取不同脂质材料固体脂质纳米粒的能力高低顺序为三硬脂酸甘油酯（三甘酯）SLN＞单硬脂酸甘油酯（单甘酯）SLN＞硬脂酸SLN＞山嵛酸甘油酯SLN。在此基础上,本研究以抗肿瘤药物紫杉醇为药物模型,制备负载紫杉醇的固体脂质纳米粒,考察纳米粒的粒径、电位、药物包封率、载药量、细胞转运能力与紫杉醇固体脂质纳米粒的细胞毒性的相互关系。研究表明,与游离药物溶液（溶剂为Cremophor:无水乙醇=1:1（V/V））相比,紫杉醇经固体脂质纳米粒包封后,药物的细胞毒性显著增强,其中以单甘酯SLN的细胞药效最佳;以具有快速细胞转运能力的三甘酯为基本材料制备的紫杉醇SLN,由于其较低的载药量和包封率,并未显示出较高的细胞毒性。经聚乙二醇单硬脂酸酯（polyethylene glycol monostearate,PEG-SA,乙二醇聚合度为40）修饰后的单甘酯SLN,细胞摄取增加,但其在细胞水平的药效未见增加。纳米粒的细胞摄取可通过受体介导的内吞来进一步优化。大多数肿瘤细胞表面的叶酸受体数目和活性明显高于正常细胞,因此用传统方法难以治疗的恶性肿瘤可以通过叶酸受体的介导进行靶向治疗。本研究进一步合成了叶酸-硬脂酸嫁接物（folic acid-stearic acid,FA-SA）,通过溶剂扩散法制备叶酸修饰单甘酯固体脂质纳米粒。利用叶酸受体在多种肿瘤细胞表面高度表达的特点,以期实现固体脂质纳米粒的高效肿瘤细胞摄取。研究表明,经FA-SA修饰后,单甘酯固体脂质纳米粒的细胞摄取与其给药系统在细胞水平的药效均有所增加。以单甘酯为固体脂质材料,油酸为液体脂质材料,溶剂扩散法制备纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers,NLC）。以A549细胞为模型细胞,用ODA-FITC标记含不同比例液体脂质的NLC,荧光倒置显微镜观察并比较细胞对含不同比例液体脂质的NLC的摄取能力,并测定荧光强度。研究表明,NLC的细胞摄取随着脂质材料中油酸比例的增加而增加。以紫杉醇为模型药物,制备载药NLC。随着油酸含量的增加,NLC的药物包封率、载药量、药物释放速率随之增加。体外细胞毒性实验结果显示:空白NLC为低细胞毒性载体;与游离药物相比,载紫杉醇的NLC的细胞毒性显著增强,且随着油酸比例的增加而增加。本研究合成了FA-SA用于修饰NLC来实现叶酸受体介导的纳米粒细胞摄取,结果发现与游离药物相比,叶酸修饰NLC在细胞水平的药效提高了86倍。多药耐药（multidrug resistance,MDR）是当前临床上恶性肿瘤化疗失败的主要因素之一。在目前所发现的导致肿瘤细胞产生MDR的机制中,最普遍也是研究最广泛的是P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的作用,P-gp以ATP能量依赖的方式主动地将药物（主要是疏水性药物,如紫杉醇、阿霉素等）从细胞内“泵出”到细胞外,使细胞内药物浓度下降,导致细胞毒作用减弱或丧失,产生耐药现象。有研究表明,纳米粒给药系统可以保护包封药物进入细胞,避免P-gp药泵的作用,从而克服耐药性。本研究进一步考察了脂质纳米载体的逆转耐药肿瘤细胞的耐药作用。以乳腺癌细胞MCF-7敏感株、MCF-7耐药株（MCF-7/ADR）为模型细胞,用四唑盐比色法（MTT Assay）法分别评价载紫杉醇或阿霉素SLN和NLC在敏感和耐药株上的毒性,考察SLN和NLC给药系统的药效和逆转多药耐药细胞的耐药性能力。与游离药物溶液比较,SLN和NLC包封紫杉醇和阿霉素后,有效地增强了它们对MCF-7和MCF-7/ADR的细胞毒性,紫杉醇SLN和阿霉素SLN对MCF-7耐药细胞的逆转倍数分别为31.0和4.3,紫杉醇NLC和阿霉素NLC对MCF-7耐药细胞的逆转倍数分别为34.3和6.4。经FA-SA修饰后,叶酸修饰紫杉醇NLC和阿霉素NLC对MCF-7/ADR的逆转倍数分别增加至52.2和8.3。
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