重组脂肪氧合酶的培养条件优化及其在小麦粉中的应用

论文摘要

脂肪氧合酶广泛存在于植物、微生物中,具有强筋和漂白的作用,能够作为面粉改良剂溴酸钾和过氧化苯甲酰的潜在替代物,因而成为目前绿色食品添加剂研究开发方面的热点。与传统的面粉改良剂相比,脂肪氧合酶作为新型的面粉改良剂具有安全、营养、健康等方面的优势,但是由于其从各种植物中（如大豆）提取所得到的产量较低,所得产物纯度不高等因素的影响,使其在大规模生产应用方面难以有较大的突破。本研究主要对重组鱼腥藻脂肪氧合酶基因在大肠杆菌中的表达及其培养条件进行优化,并展开了重组脂肪氧合酶的酶学性质研究；还对重组脂肪氧合酶在小麦粉中应用进行了初步探讨。主要研究结果如下：1.脂肪氧合酶基因在大肠杆菌中的表达以及培养条件优化。将脂肪氧合酶（Lox）基因与大肠杆菌胞内表达载体pET-32a连接,构建重组质粒pET-32a-ana-Lox,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。并对诱导培养条件进行正交试验优化,结果表明：诱导浓度为1 g/L,诱导时间16 h,诱导时机为OD600为0.8时,此时重组ana-Lox酶活产量为812 U/mL。2.重组脂肪氧合酶的分离纯化及其性质研究。重组酶BL21/pET-32a-ana-Lox通过Ni柱亲合层析得到电泳纯的脂肪氧合酶蛋白,并研究重组酶的酶学性质。结果表明：通过对电泳纯的脂肪氧合酶蛋白的测定,重组酶BL21/pET-32a-ana-Lox比活达到13.7U×103/mg蛋白,纯化倍数达到23.3倍,酶活回收率为61.9%,分子量约为66kDa左右；重组酶最适反应pH为6.0,最适反应温度为45℃；重组ana-Lox热稳定性不高；金属离子Fe2+重组酶有激活作用；Mg2+、Ca2+较弱的激活作用。3.重组脂肪氧合酶在小麦粉中的应用。重组脂肪氧合酶对小麦粉具有强筋和漂白的作用。重组脂肪氧合酶氧化面团中水溶性蛋白和SDS可溶性蛋白中的-SH,面团中水溶性蛋白和SDS可溶性蛋白中的-SH分别在其添加量为10 U/g和4 U/g时达到最低值；而未被还原的二硫键（-S-S-）的量分别在10 U/g和4 U/g时达到最高值。同时,重组脂肪氧合酶还会促进水溶性蛋白和可溶性蛋白间发生物理或化学交联,面团中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麦谷蛋白的提取量分别在其添加量为6U/g、6U/g、4U/g、4U/g时达到最大值;与KBrO3的比较研究表明,脂肪氧合酶氧化速度较快,易于造成对SDS可溶性蛋白（醇溶蛋白、麦谷蛋白）的过度氧化,从而使小麦粉得品质受影响。脂肪氧合酶对小麦粉中类胡萝卜素具有降解作用,类胡萝卜素的含量在重组ana-Lox添加量为8U/g时达到最低值。温度对于脂肪氧合酶对β-胡萝卜素的氧化具有重要的作用,在最适温度40℃时,β-胡萝卜素的降解率较高。质构结果表明,面包测定的相关性指标（硬度、弹性、咀嚼度、粘结性等）分别在重组ana-Lox添加量为4 U/g、8 U/g、8 U/g、8 U/g时达到最大值。

论文目录

• 图形索引
• 表格索引
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 面粉品质改良剂的应用现状
• 1.1 化学品质改良剂在面粉中的应用
• 1.2 酶制剂在面粉品质改良中的应用
• 1.2.1 淀粉酶
• 1.2.2 脂肪酶
• 1.2.3 葡萄糖氧化酶
• 1.2.4 蛋白酶
• 1.2.5 戊聚糖酶
• 1.2.6 谷氨酰胺转氨酶
• 2 脂肪氧合酶的研究进展
• 2.1 脂肪氧合酶的来源
• 2.2 脂肪氧合酶的分子结构
• 2.3 脂肪氧合酶的催化性质
• 2.4 脂肪氧合酶基因的克隆表达
• 2.5 脂肪氧合酶的应用现状
• 3 大肠杆菌表达系统概述
• 3.1 大肠杆菌表达系统的优点
• 3.2 大肠杆菌表达系统的缺点
• 4 重组大肠杆菌的培养
• 4.1 培养技术概述
• 4.2 影响大肠杆菌培养的外界条件
• 4.2.1 培养基
• 4.2.2 温度
• 4.2.3 pH
• 4.2.4 溶解氧浓度
• 4.2.5 质粒稳定性
• 4.2.6 细胞破碎
• 5 本研究的目的意义和内容
• 5.1 研究目的意义
• 5.2 研究内容
• 第二章 重组脂肪氧合酶基因的表达及培养条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 培养基与主要溶液
• 1.2 方法
• 1.2.1 大肠杆菌感受态的制备
• 1.2.2 载体转化大肠杆菌感受态细胞
• 1.2.3 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 1.2.4 重组脂肪氧合酶活性测定
• 1.2.5 重组质粒稳定性检测
• 1.2.6 培养条件正交试验
• 2 结果与分析
• 2.1 培养基对重组ana-Lox诱导表达的影响
• 2.2 诱导剂乳糖浓度的影响
• 2.3 诱导时机的影响
• 2.4 诱导时间的影响
• 2.5 起始培养基pH的影响
• 2.6 装液量的影响
• 2.7 发酵条件正交试验结果
• 2.8 重组质粒稳定性检测
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 重组脂肪氧合酶的分离纯化及酶学性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 培养基与主要溶液
• 1.2 方法
• 1.2.1 重组蛋白的纯化
• 1.2.2 重组酶酶学性质研究
• 2 结果与分析
• 2.1 重组ana-Lox蛋白的纯化
• 2.2 重组ana-Lox酶学性质研究
• 2.2.1 重组酶反应的最适温度
• 2.2.2 重组酶的热稳定性
• 2.2.3 重组酶反应的最适pH
• 2.2.4 重组酶的pH稳定性
• 2.2.5 金属离子对重组酶活性的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 重组脂肪氧合酶对小麦粉特性改变的初步研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验样品
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 测定样品
• 1.1.4 面团制作和取样
• 1.2 面团面筋蛋白和非面筋蛋白中-SH含量的测定
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 主要仪器
• 1.2.3 方法
• 1.3 面团中面筋蛋白和非面筋蛋白中被还原抑制的-S-S-的含量测定
• 1.3.1 试剂
• 1.3.2 主要仪器
• 1.3.3 方法
• 1.4 面团中不同蛋白质组分的提取
• 1.4.1 试剂
• 1.4.2 主要仪器
• 1.4.3 蛋白质各组分的提取
• 1.5 面团中类胡萝卜素的测定
• 1.5.1 试剂
• 1.5.2 主要仪器
• 1.5.3 方法
• 1.6 β-胡萝卜素氧化试验
• 1.6.1 试剂
• 1.6.2 主要仪器
• 1.6.3 方法
• 1.7 面团质构性质测定
• 1.7.1 主要仪器
• 1.7.2 方法
• 2. 结果与分析
• 3对面筋蛋白和非面筋蛋白内-SH含量的影响'>2.1 重组ana-Lox和KBrO₃对面筋蛋白和非面筋蛋白内-SH含量的影响
• 3对面筋蛋白和非面筋蛋白内-S-S-的还原抑制'>2.2 重组ana-Lox和KBrO₃对面筋蛋白和非面筋蛋白内-S-S-的还原抑制
• 3对面团中不同蛋白组分提取的影响'>2.3 重组ana-Lox和KBrO₃对面团中不同蛋白组分提取的影响
• 3对面团中类胡萝卜素的影响'>2.4 重组ana-Lox和KBrO₃对面团中类胡萝卜素的影响
• 2.5 重组脂肪氧合酶氧化β-胡萝卜素试验
• 3对面团质构性质的影响'>2.6 重组ana-Lox和KBrO₃对面团质构性质的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 论文创新点
• 致谢