产低温纤维素酶菌株筛选及发酵条件研究

论文摘要

纤维素酶（Cellulase）是一种降解纤维素产生葡萄糖的酶类,已被广泛的应用于食品、酿造、皮革、胶原纤维和饲料工业等诸多行业。而近年来纤维素酶作为一种新型饲料添加剂的应用得到人们的广泛重视。本研究从黄海长海县附近海泥和海水分离筛选共得到14株能够分解纤维素的菌种,通过液体发酵酶活力比较筛选出菌株SWD-28为出发菌株,经形态学及ITS序列鉴定其为Penicillium cordubense。以青霉（Penicillium sp.） SWD-28为实验材料,在单因素试验的基础上,采用Plackett-Burman（P-B）设计和响应面试验设计（RSM）对产酶进行优化。影响SWD-28产酶的主要因素为玉米粉、硫酸铵和麸皮的添加量,最佳浓度为玉米粉2.2%,硫酸铵0.24%,麸皮1.5%,此时滤纸酶活力为109.8 U/mL,是优化前的2.25倍。同样以SWD-28为实验材料,在单因素试验的基础上,采用Plackett-Burman（P-B）方法和响应面试验设计（RSM）对产酶条件进行优化。影响SWD-28产酶的主要因素为温度、种龄和接种量,最佳发酵条件为转速150r/min、种龄33h、装液量100mL、pH 5、接种量12.5%、温度17℃,此时滤纸酶活力为219.9U/mL,是优化前的2.01倍。对该菌株产的粗酶液进行硫酸铵盐析和Sephadex G100柱层析,比活力达到26.4U/mg,提高20.6倍,回收率13.1%。得到一个电泳纯的低温葡聚糖内切酶,分子量为33.1 kD。经圆二色对其结构进行检测,发现其α-螺旋占49.9%,p-折叠占0.0%,转角占24.3%,随机卷曲占25.8%,呈典型α螺旋。对其酶学性质进行初步研究,结果表明其最适pH为5.0,最适反应温度为35℃,在5℃酶活力仍能保持60%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1.1 纤维素酶的研究进展
• 1.1.1 纤维素酶结构及分类
• 1.1.2 纤维素酶的来源
• 1.1.3 纤维素酶应用
• 1.2 低温纤维素酶的研究进展
• 1.2.1 低温纤维素酶的来源
• 1.2.2 低温纤维素酶酶学性质
• 1.2.3 低温纤维素酶结构及适冷机理
• 1.2.4 基因克隆和表达
• 1.3 本论文立题意义
• 2 实验仪器及试剂
• 2.1 实验仪器
• 2.2 实验试剂
• 3 低温纤维素酶产生菌筛选
• 3.1 材料
• 3.1.1 样品
• 3.1.2 培养基及培养条件
• 3.1.3 试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 葡萄糖标准曲线测定
• 3.2.2 菌株筛选方法
• 3.2.3 菌种鉴定
• 3.2.4 酶活力测定方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 葡萄糖标准曲线绘制
• 3.3.2 菌株的分离鉴定
• 3.3.3 菌株的形态学特征
• 3.3.4 菌株的ITS-rDNA鉴定
• 3.5 小结
• 4 青霉SWD-28发酵培养基研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 发酵方法
• 4.2.2 低温纤维素粗酶液的制备方法
• 4.2.3 酶活测定方法
• 4.2.4 菌体最适培养温度
• 4.2.5 生长曲线
• 4.2.6 酶活曲线测定
• 4.2.7 发酵培养基优化
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 最适培养温度的确定
• 4.3.2 生长曲线
• 4.3.3 酶活曲线
• 4.3.4 发酵培养基优化
• 4.4 小结
• 5 青霉SWD-28发酵条件研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基
• 5.2 方法
• 5.2.1 摇瓶产酶试验
• 5.2.2 纤维素粗酶液的制备
• 5.2.3 酶活测定方法
• 5.2.4 发酵条件优化
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 发酵条件优化
• 5.4 小结
• 6 低温纤维素酶的酶学性质初步研究
• 6.1 材料
• 6.1.1 菌株
• 6.1.2 培养基
• 6.2 方法
• 6.2.1 摇瓶产酶
• 6.2.2 酶活测定方法
• 6.2.3 蛋白质含量测定方法
• 6.2.4 酶的分离纯化
• 6.2.5 不连续垂直平板SDS-PAGE电泳
• 6.2.6 圆二色谱法测定二级结构
• 6.2.7 酶学性质
• 6.3 结果
• 6.3.1 蛋白质含量标准曲线
• 6.3.2 酶的分离纯化
• 6.3.3 SDS-PAGE电泳
• 6.3.4 圆二色谱法检测蛋白结构
• 6.3.5 低温葡聚糖内切酶酶学性质的初步研究
• 6.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A ITS序列分析图
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢