明尼苏达被毛孢（Hirsutella minnesotensis）相关种分类及其分子生态学研究

论文摘要

植物寄生线虫是重要的植物病原物，给农业生产造成巨大的损失，生物防治是控制植物寄生线虫的有效途径之一。但是，植物寄生线虫生防菌剂的研发和应用受到了一定程度的限制，主要原因是缺乏高效的生防资源、对生防菌剂的生态学缺乏了解等。大豆胞囊线虫病是大豆生产上最重要的病害，造成的损失几乎等于其它病害损失之和，洛斯里被毛孢（Hirsutella rhossiliensis）和明尼苏达被毛孢（H.minnesotensis）是目前发现的两种重要的线虫内寄生菌，不仅在自然条件下对大豆胞囊线虫起着重要的控制作用，而且是具有广泛应用前景的生防资源。本研究对食线虫被毛孢及其相关种进行了分类研究；建立了明尼苏达被毛孢实时荧光定量PCR检测体系；将实时荧光定量PCR检测方法应用于田间土样明尼苏达被毛孢的检测；实时荧光定量PCR结合寄生率测定方法，研究土壤因子对明尼苏达被毛孢在土壤中的定殖和寄生活性。 线虫内寄生被毛孢及其相关种的分类。线虫内寄生被毛孢不同种及菌株间存在着形态、致病性和遗传多样性，明尼苏达被毛孢与寄生螨类的汤普森被毛孢（H.thompsonii）在形态上极为相似，针对这些问题进行了形态学和rDNA ITS和MAPK基因分析研究，发现寄生腐生线虫的被毛孢新种--线虫被毛孢（Hirsutella vermicola sp.nov.）。该新种与洛斯里被毛孢的区别主要是产孢细胞顶部呈螺旋状，对植物寄生线虫不寄生或寄生性很弱。同时证明汤普森被毛孢的三个变种划分不成立，修订了汤普森被毛孢种的特征，进一步证明明尼苏达被毛孢与汤普森被毛孢是完全不同的种。 明尼苏达被毛孢实时荧光定量PCR体系。明尼苏达被毛孢是我国大豆胞囊线虫幼虫最重要的寄生菌，可能是我国大豆胞囊线虫自然衰退的主要生防因子，通过对明尼苏达被毛孢rDNA ITS区分析，设计出特异性的上游引物5’-GGGAGGCCCGGTGGA-3’和下游引物5’-TGATCCGAGGTCAACTTCTGAA-3’以及TaqMan探针5’-CGTCCGCCGTAAAACGCCCAAC-3’，通过PCR反应体系优化、专化性和孢子灵敏度测定，建立了特异性的对土壤中明尼苏达被毛孢定量测定的实时荧光定量PCR体系，并且理论上能够检测到4个孢子／g土。 实时荧光定量PCR方法对田间土样的检测。利用建立的实时荧光定量PCR方法结合幼虫寄生率分析，对采自黑龙江省大豆田的20份土样进行了研究，在9份土样中分离到明尼苏达被毛孢，3份土样既没有幼虫寄生也没有检测到明尼苏达被毛孢的DNA，在有真菌寄生的17份土样中，6份土样能够检测到明尼苏达被毛孢，包括了所有幼虫寄生率大于10％的5份土样。这些结果证明实时荧光定量PCR能够定量检测自然土壤样品中的明尼苏达被毛孢，与寄生率分析存在

论文目录

• 第一章 植物寄生线虫的生物防治及分子生态学研究进展
• 1 植物寄生线虫
• 1.1 线虫的重要性
• 1.2 植物寄生线虫的类群
• 1.3 大豆胞囊线虫
• 1.4 植物寄生线虫防治现状
• 2 植物寄生线虫的生物防治
• 2.1 线虫生防细菌
• 2.2 食线虫真菌
• 3 线虫内寄生真菌被毛孢
• 3.1 被毛孢种类
• 3.2 变异性
• 3.3 生态学
• 3.4 生防效果
• 4 分子生态学
• 4.1 实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）
• 4.2 GFP基因标记
• 5 本研究的目的和内容
• 5.1 研究目的
• 5.2 研究内容
• 第二章 食线虫被毛孢及相关种的分类
• 1 材料与方法
• 1.1 试验菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 菌株的培养
• 1.4 显微测量及照相
• 1.5 真菌DNA的提取
• 1.6 PCR扩增及测序
• 1.7 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 线虫被毛孢与洛斯里被毛孢
• 2.2 汤普森被毛孢与明尼苏达被毛孢的分类
• 3 讨论
• 第三章 明尼苏达被毛孢实时荧光定量PCR检测体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试验菌株及来源
• 1.2 培养基及真菌的培养
• 1.3 真菌DNA的提取及PCR扩增
• 1.4 实时荧光定量PCR检测体系的建立及优化
• 1.5 制备定量标准曲线
• 1.6 实时荧光定量PCR检测土壤中明尼苏达被毛孢孢子的灵敏度
• 2 结果与分析
• 2.1 实时荧光定量PCR引物及Taqman探针
• 2.2 实时荧光定量PCR引物和Taqman探针的特异性
• 2.3 实时荧光定量PCR反应体系的优化
• 2.4 定量标准曲线
• 2.5 土壤中孢子灵敏度的检测
• 3 讨论
• 第四章 田间土壤样品中被毛孢的实时荧光定量PCR检测
• 1 材料与方法
• 1.1 试验土壤样品
• 1.2 线虫寄生率检测
• 1.3 实时荧光定量PCR检测
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第五章 土壤环境因子对明尼苏达被毛孢动态影响
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 培养基
• 1.3 真菌的培养及收集
• 1.4 大豆胞囊线虫二龄幼虫的制备
• 1.5 土壤的处理
• 1.6 试管土实验
• 1.7 真菌对线虫的寄生率测定
• 1.8 试管土中明尼苏达被毛孢DNA含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 土壤温度对明尼苏达被毛孢的生长及其对线虫寄生性的影响
• 2.2 土壤湿度对明尼苏达被毛孢的生长及其对线虫寄生性的影响
• 2.3 土壤质地对明尼苏达被毛孢的生长及其对线虫寄生性的影响
• 3 讨论
• 3.1 明尼苏达被毛孢的生物学和生态学
• 3.2 土壤温度对明尼苏达被毛孢的影响
• 3.3 土壤湿度对明尼苏达被毛孢的影响
• 3.4 土壤质地对明尼苏达被毛孢的影响
• 结论
• 参考文献
• 论文缩略词表
• 致谢
• 作者简历
• 在读期间发表的学术论文