赤芍与白芍的药动学研究与化学成分的液质联用分析

论文摘要

赤芍与白芍为我国常用中药材。赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii Lynch直接使用的干燥根;白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.水煮去皮后晒干使用的根。二者来源相近,但临床功效却不尽相同。赤芍具有清热凉血,散瘀止痛的功效,用于温毒发斑,吐血衄血,目赤肿痛,肝郁胁痛,经闭痛经,癥瘕腹痛,跌扑损伤,痈肿疮疡。而白芍具有平肝止痛,养血调经,敛阴止汗的功能,主要用于头痛眩晕,胁痛,腹痛,四肢挛痛,血虚萎黄,月经不调,自汗和盗汗。本研究即从化学成分与药动学两方面着手,探讨两药材基源相近却功效迥异的原因。在提取分离制备白芍和赤芍有效成分芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷的基础上,采用液相色谱-质谱联用技术研究大鼠灌胃赤芍或白芍提取物后芍药苷、芍药内酯苷和氧化芍药苷的药物动力学特征,并初步探讨两药材的药动学特征的差异。对赤芍、白芍、川赤芍与常用混淆品新疆芍药的化学成分进行HPLC-MS定性分析,并比较化学成分的差异。本研究对阐明赤芍、白芍的作用机制和药效物质基础做出了有价值的探索,对指导临床用药具有重要意义。第一部分川赤芍化学成分研究（芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷的制备）目的:从川赤芍中分离制备芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷3种成分。方法:采用硅胶柱色谱与ODS柱色谱的方法对川赤芍醇提物进行系统分离纯化,通过薄层、UV和HPLC等方法对其分离产物进行鉴定。结果:提取分离得到3个化合物,分别鉴定为芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷。所得芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷用归一化法定量,纯度均大于98%。结论:本法简便,制备成本低,芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷可作为定性定量分析使用的对照品,也可用于药物代谢动力学的研究。第二部分赤芍与白芍提取物的药动学研究目的:建立高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）法同时测定大鼠血浆中芍药苷、芍药内酯苷和氧化芍药苷的浓度,并将其用于SD大鼠灌胃赤芍或白芍提取物后血浆中3种成分的药动学研究,初步比较赤芍和白芍两种药材药动学特征的差异。方法:以0.2g·g-1相同生药量灌胃给与大鼠赤芍或白芍提取物,分别于给药后5,10,15,20,30,60,90,120,180,240,360和540min眼内眦静脉丛取血,制备血浆样品后,采用甲醇沉淀蛋白的方法进行预处理,采用HPLC-MS法,以栀子苷为内标进行分析:（1）色谱条件:色谱柱为Agilent Zorbax-C18柱（150mm×4.6mm,5μm）,流动相为甲醇-0.1%甲酸水（33:67）,流速为0.7mL·min-1。（2）质谱条件:ESI源,源电压- 4500 V,负离子检测,源温度650℃,雾化气（gas 1） 60 psi,加热气（gas 2）65 psi,帘气25 psi。检测方式为多反应监测（MRM）模式,用于定量分析检测的离子及各自的解簇电压（DP）和裂解电压（CE）分别为m/z 525.2→121.0（芍药苷）,DP -22V,CE -37eV;m/z 525.2→121.0（芍药内酯苷）,DP -30V,CE -37eV;m/z 495.2→137.0（氧化芍药苷）,DP -65V,CE -40eV和m/z 433.2→225.1（内标栀子苷）,DP -20V,CE -19eV。结果:芍药苷、芍药内酯苷和氧化芍药苷的线性范围分别为0.9262185.2,1.858178.6和0.768938.22ng·mL-1,最低定量限分别为0.9262,1.858和0.7689 ng。日内和日间精密度（RSD）在0.5%和6.3%之间。其提取回收率在85.6%和105.2%之间。大鼠灌胃赤芍提取物后,3个主要成分芍药苷、芍药内酯苷和氧化芍药苷的药物动力学参数如下: T1/2分别为1.86±0.27,1.17±0.33和1.59±0.53 h,Tmax分别为0.67±0.07,0.33±0.15和0.33±0.06 h,ke分别为0.35±0.10,0.59±0.09和0.44±0.06 h,Cmax分别为185.24±26.24,122.08±30.41和16.64±4.53 ng·ml-1,AUC0-t分别为48572.38±480.18,7796.00±125.33和69.73±5.52 ng·h·ml-1,AUC0-∞分别为52274.73±489.32,8804.31±100.92和83.92±2.99 ng·h·ml-1。大鼠灌胃白芍提取物后,芍药内酯苷出现了双峰现象,Tmax1和Tmax2分别为0.33±0.05和0.67±0.07 h,Cmax1和Cmax2分别为178.60±35.39和180.86±29.77 ng·ml-1,芍药苷和氧化芍药苷的Tmax分别为0.33±0.02和0.67±0.23 h,Cmax分别为34.44±13.42和19.22±3.81 ng·ml-1,3个主要成分芍药苷、芍药内酯苷和氧化芍药苷的其他药物动力学参数如下:T1/2分别为0.85±0.11,1.06±0.13和2.21±0.78 h,ke分别为0.79±0.29,0.59±0.09和0.44±0.06 h,AUC0-t分别为288.66±80.38,14865.04±239.59和79.03±9.31 ng·h·ml-1,AUC0-∞分别为315.08±85.44,15646.40±228.44和99.27±8.76 ng·h·ml-1。白芍和赤芍中3个成分的AUC0-t、AUC0-∞之和分别为56438.11、61162.96 ng·h·ml-1和15232.73、16060.76 ng·h·ml-1。结论:本文建立了同时测定血浆中芍药苷、芍药内酯苷和氧化芍药苷的HPLC-MS法,并将其应用于SD大鼠灌胃赤芍或白芍提取物后3种成分的药动学研究,并将得到的药动学参数进行综合,初步研究了赤芍和白芍两种药材药动学性质的差异。第三部分赤芍与白芍化学成分的HPLC-MS分析目的:建立HPLC-MS法定性分析赤芍、白芍、川赤芍和新疆芍药的化学成分,考察4种药材的化学成分差异。方法:对芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷和苯甲酰芍药苷对照品进行一级质谱（Q1）、子离子（Product ion）、母离子（Precusor ion）等多种扫描模式,分析其电喷雾电离质谱裂解途径,并总结单萜苷类成分的质谱裂解特征。采用超声提取法制备4种药材的50%乙醇提取液,高速离心取上清液进行HPLC-MS分析:（1）色谱条件:Agilent Zorbax C18柱（250mm×4.6mm,5μm）,流动相为甲醇-0.1%甲酸水,梯度洗脱（08min,08%甲醇;810min,820%甲醇;1030min,2030%甲醇;3040min,3040%甲醇;4065min,4060%甲醇;6575min,6090%甲醇;7580min,90%甲醇）,流速为1mL·min-1。（2）质谱条件:ESI源;源电压- 4500 V;负离子检测;源温度（TEM）:650℃;雾化气（gas 1） :65 psi,加热气（gas 2）: 65 psi,帘气（CUR）:25 psi。检测方式为多离子监测-自动信息关联-增强型子离子（MRM-IDA-EPI）模式,扫描质量范围m/z 501000。结果:在负离子模式下,芍药单萜苷类结构中蒎烷基本骨架产生的m/z 165碎片离子较常见,这一离子可作为芍药苷类化合物的特征性碎片离子。同时葡萄糖或蒎烷骨架结构连有不同的取代基时,相应的碎片离子也会出现。根据化合物的特征碎片离子,推测出11个芍药苷类化合物, 4种糖类化合物以及2种酸或酯类化合物共17种。其中大部分化合物在这4种药材中广泛存在。白芍中未能检测到去苯甲酰基芍药苷及其异构体;芍药苷亚硫酸酯仅出现在白芍和赤芍药材中;川赤芍中未能检测到没食子酸甲酯;四没食子酰基葡萄糖仅赤芍药材中未能检出。结论:本文建立的HPLC-MS方法可用于赤芍、白芍、川赤芍和新疆芍药的化学成分定性研究,为白芍和赤芍药效物质基础的阐明奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 赤芍与白芍的药动学研究与化学成分的液质联用分析
• 引言
• 第一部分 川赤芍化学成分研究（芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷的制备）
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 赤芍与白芍提取物的药动学研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 赤芍与白芍化学成分的HPLC-MS 研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述 液质联用技术在中药研究中的应用
• 致谢
• 个人简历