论文摘要
目的:探讨脑出血（intracerebral hemorrhage,简称ICH）模型大鼠血肿周围脑组织神经生长因子（nerve growth factor,NGF）及血管内皮生长因子（Vascular endothelium growth factor,VEGF）的变化规律及不同频率电针治疗对它们的影响。方法:3月龄SD雄性大鼠232只,体重250-300g,按随机数字表法随机分为空白对照组（简称空白组）8只,假手术组56只,ICH模型组（简称模型组）56只,ICH+电针低频组（简称低频组）56只,ICH+电针高频组（简称高频组）56只。后4组再随机分6小时（hour,h）24h组、72h组、1w（week,w）组、2w组、3w组和4w组,每组各8只。模型组与针刺组采用脑立体定位仪向SD大鼠右侧脑尾状核注入0.6U（0.2U/μl）胶原酶Ⅶ建立ICH模型;假手术组向脑内注入3μl的生理盐水;空白组不手术。空白组、假手术组与模型组均不予治疗;针刺取大鼠大椎、风府、水沟穴,针刺后大椎与风府二穴接华佗牌电针仪,电针低频组采用频率2赫兹（hertz,Hz）,波宽0.175毫秒（millisecond,ms）,电流强度为1毫安（milliampere,mA）、电压1伏（volt,V）的电针参数;电针高频组采用频率100 Hz,波宽0.175ms,电流强度为1mA、电压1V的电针参数,每次电针刺激30分钟（minute,min）,每日1次。运用行为学、免疫组化学及病理学等方法,观察ICH大鼠的神经功能缺损评分（neurological deficit score,NDS）、NGF、VEGF在不同时点的变化规律及针刺对以上指标的影响。结果1.不同频率电针均能改善ICH大鼠的神经功能缺损实验发现,模型组6h即出现神经功能缺损,24h达到高峰,72h开始恢复,至1w时明显改善,2w基本恢复,3w后缺损评分为0分。组内比较显示,24h缺损评分较72h、1w、2w、3w、4w显著升高（P＜0.01）,即在24h时神经功能缺损最严重。电针低频组与高频组6h时神经功能缺损最严重,在24h时神经功能即开始出现恢复的趋势,即神经功能恢复较模型组早。组间比较也显示,低频组和高频组在24h、72h和1w时的神经功能缺损均较模型组相应减轻,即两个电针组的神经功能恢复早且神经功能缺损较轻。病死率方面:模型组病死率为21.43%,低频组为10.71%,高频组为12.50%,采用x2检验显示,与模型组比较,低频组与高频组三组的病死率无显著性差异（P＞0.05）。2.ICH模型大鼠脑组织病理学变化光镜下可见模型组6h弥漫出血,神经细胞大面积损伤,组织溶解,细胞间隙出现大小不等的空泡;24h血肿红细胞溶解,血肿周围可见裂解的细胞核以及胞浆嗜酸性的神经元,血肿周围可见大量的肿胀细胞,细胞外和血管周围水肿突出。血肿边缘可见大量成团的中性粒细胞浸润,脓肿形成;72h血肿中心区可见红细胞开始吸收,组织水肿和细胞间隙空化最为明显,血肿周围出现泡沫细胞,胶质细胞增生,中性粒细胞弥漫散在;1w时血肿明显吸收,水肿较前明显消退,细胞肿胀减轻,血肿周围存在大量的泡沫细胞,呈慢性炎症及纤维结缔组织增生,2w后血肿基本吸收,无明显水肿,血肿周围呈慢性炎症和纤维结缔组织增生。电针低频组和高频组较模型组细胞形态排列规整,72h时水肿程度较ICH模型组减轻,神经细胞损伤程度较模型组轻,1w时脑水肿基本消失。3.不同频率电针对ICH大鼠血肿周围脑组织NGF蛋白的影响免疫组化显示:空白组有淡黄色NGF蛋白阳性细胞表达。模型组从6h至1w时NGF蛋白一直处于低表达,见少量淡染的NGF蛋白表达,2w后开始表达增加,血肿周围组织见黄色深染的NGF蛋白阳性神经细胞表达,至4w仍为高表达。统计学分析显示,模型组6h至1w时NGF蛋白表达较低,2w后表达开始增加,4w时仍为高表达。组内比较显示,模型组6h、24h、72h、1w时的NGF蛋白表达显著低于2w、3w、4w时的表达（P＜0.01）,2w时的表达显著低于4w时的表达,显示,随着ICH的恢复,NGF蛋白的表达增加,以2w以后表达增加明显。假手术组、低频组和高频组NGF蛋白的表达趋势与模型组的相同。组间比较显示,假手术组6h～72h,模型组6h、24h、1w,低频组与高频组24h～1w时的NGF蛋白表达均显著低于空白组的表达（P＜0.05或0.01）,而假手术组3w、4w,模型组、低频组和高频组2w、3w、4w时的NGF蛋白表达则均显著高于空白组的表达（P＜0.05或0.01）。模型组2w、低频组和高频组2w、3w、4w时的NGF蛋白表达均显著高于假手术组相应时间点的NGF蛋白表达（P＜0.01）。与模型组比较,低频组和高频组6h、3w、4w的NGF蛋白表达均显著高于模型组相应时间点的表达（P＜0.01）。低频组与高频组比较发现,高频组2w和4w时NGF蛋白表达显著高于低频组（P＜0.05或0.01）。结果提示,ICH后随着时间的推移,NGF蛋白的表达逐渐增多,低频与高频电针均能够提高血肿周围NGF蛋白的表达,以2w以后表达增加明显。高频率电针和低频率电针之间的比较发现,高频率电针在提高NGF蛋白方面较低频率电针更具有优势。4.不同频率电针对ICH大鼠血肿周围脑组织VEGF蛋白的影响免疫组化显示:空白组有淡黄色VEGF蛋白阳性细胞表达。模型组从24h至4w血肿周围组织见多量黄色深染的VEGF蛋白阳性神经细胞表达（见图60-89）。统计学分析显示,模型组24h起开始出现VEGF蛋白的高表达,并随着时间的延长逐渐升高,一直至4w时仍为高表达。组内比较显示,模型组6h显著低于72h、1w、2w、3w、4w时的VEGF蛋白表达（P＜0.05或0.01）,提示随着时间的推移,VEGF蛋白的表达逐渐增加。假手术组、低频组和高频组VEGF蛋白的表达趋势与模型组的相同。组间比较显示,假手术组、低频组和高频组24h～4w,模型组72h～4w时的VEGF蛋白表达均显著高于空白组的表达（P＜0.05或0.01）。模型组2w、3w,低频组72h～3w和高频组1w～3w时的VEGF蛋白表达均显著高于假手术组相应时间点的VEGF蛋白表达（P＜0.05或0.01）。低频组24h和72h VEGF蛋白的表达均显著高于模型组相应时间点的表达（P＜0.01）。高频组和模型组VEGF蛋白的表达无显著性差异,低频组与高频组VEGF蛋白的表达也无显著性差异（P＞0.05）。结果提示,VEGF蛋白的表达在ICH后24h起逐渐增高,低频电针在ICH急性期能够提高VEGF蛋白的表达,与模型组有显著性差异,而高频电针组VEGF蛋白的表达与模型组的VEGF蛋白的表达无显著性差异。低频电针在ICH急性期提高VEGF蛋白的表达,一方面有可能增加通过血管通透性,破坏血脑屏障,促进脑水肿,进而加重脑损伤;另一方面,有可能通过神经营养作用,在新血管形成之前对神经系统起着直接保护作用,避免皮质神经元遭受低氧和糖缺失的损害,延长细胞的存活时间。5.不同频率电针对ICH血肿周围脑组织VEGFmRNA的影响免疫组化显示:空白组有黄色VEGFmRNA表达。模型组、低频组和高频组6h均可见黄色VEGFmRNA表达,以后时间点VEGFmRNA的表达减少,染色较淡。统计学结果显示,空白组有一定量的VEGFmRNA阳性表达,假手术组各时间点均有一定量的VEGFmRNA阳性表达,各时间点VEGFmRNA的表达无显著性差异（P＞0.05）。模型组24h以后的表达降低,6h时VEGFmRNA阳性表达显著高于其它时间点的表达（P＜0.05或0.01）,其余时间点之间的比较无显著性差异（P＞0.05）。低频组VEGFmRNA阳性表达在各时间点无显著性差异（P＞0.05）。高频组6hVEGFmRNA阳性表达显著高于24h、1w、2w和3w的表达（P＜0.05或0.01）,其余时间点的比较无显著性差异（P＞0.05）。组间比较显示:假手术组6h、1w～4w,模型组24h、1w～4w,高频组24h、1w～3w时VEGFmRNA表达均较空白组显著减少（P＜0.05或0.01）。低频组各时间点VEGFmRNA的表达与空白组无显著性差异（P＞0.05）。与模型组比较,低频组在1w、2w、3w时VEGFmRNA阳性表达显著高于模型组相应时间点的表达（P＜0.05或0.01）。低频组与高频组之间VEGFmRNA阳性表达无显著性差异（P＞0.05）。从结果看,VEGF蛋白与VEGF mRNA的表达并不一致,模型组24h起开始出现VEGF蛋白的表达,并随着时间的推移,VEGF蛋白的表达逐渐升高,一直至4w时仍为高表达。而VEGFmRNA从24h开始出现降低,到4w一直为低表达。电针低频组和高频组对VEGFmRNA的表达均没有显著的升高或降低,只是表现在低频电针能够抑制ICH后VEGFmRNA的低水平表达,且在1w、2w、3w时VEGFmRNA阳性表达显著高于模型组相应时间点的表达。而高频电针仅在3w时VEGFmRNA阳性表达显著高于模型组3w时的表达。结论:ICH后随着时间的推移,NGF蛋白与VEGF蛋白的表达均增加,而VEGFmRNA的表达则降低。低频和高频电针均能够提高血肿周围NGF蛋白的表达,以2w以后表达增加,且以高频率电针在提高NGF蛋白方面较低频率电针更具有优势。而低频电针则能够增加VEGF蛋白的表达,维持VEGFmRNA的表达水平,在目前VEGF在ICH急性期尚存在争议的情况下,且对NGF蛋白的提高不如高频电针,因此建议取高频电针进行治疗。
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