人工改造猪血红蛋白和重组松弛素受体蛋白的制备和性能

论文摘要

论文分别采用人工化学改造和基因重组改造技术手段,分别对血红蛋白和松驰素受体蛋白这两类功能性蛋白进行结构改造,以获得更适于研究和应用需求的人工改造蛋白。血液资源紧缺和血源性污染等问题促使人们研究和开发血液代用品,其中以血红蛋白为基础的血液代用品备受关注。动物血资源丰富、价廉且易于避免和控制污染,是代血物的首选原料。多年来国内外研究主要集中在牛血红蛋白为基础的血液代用品。而猪血在我国来源广泛,取材容易,价格低廉,且其结构和性能与人血红蛋白十分接近,免疫原性低,氧亲和调节机制与人血红蛋白相同,是人血红蛋白的理想替代物。本论文选择猪血为原料经分离纯化制备无基质猪血红蛋白,利用多种化学修饰手段改造猪血红蛋白,并对修饰产物的结构、携氧性能等进行了研究。针对脱离红细胞后的血红蛋白容易解聚和氧亲和力过高等问题,采用氧化棉子糖、双3,5二溴水杨酸延胡索酸酯（DBBF）等小分子化合物对猪血红蛋白进行人工修饰。SDS-PAGE分析表明,经小分子修饰后的血红蛋白都发生了亚基间的共价交联。在脱氧状态下,氧化开环棉子糖修饰后的猪血红蛋白的半饱和氧分压（Pso值）为2.93kPa,希尔系数为2.1；氧解离曲线较未经修饰的猪血红蛋白明显右移,有利于调整修饰产物的携氧能力。在脱氧条件下经DBBF修饰,猪血红蛋白携氧能力得到改善。在反应混合物中加入IHP,产物的Pso明显升高。对DBBF修饰血红蛋白的反应条件进行分析,发现当两者摩尔浓度比为2：1,反应时间2小时,产物的Pso值为3.07kPa,希尔系数为2.2。聚乙二醇修饰蛋白可以增加蛋白分子量,延长其在体内循环时间,还可钝化其免疫原性。采用4种不同方法活化PEG并对猪血红蛋白进行修饰,比较了它们的修饰效率、修饰产物的携氧功能和稳定性等。进一步考察采用PEG和DBBF联合修饰猪血红蛋白的效应。结果证明联合修饰产物具有稳定的四聚体结构,半饱和氧分压Pso在3.33kPa左右,接近于生理条件下人体红细胞的Pso值。通过检测人工修饰产物对家兔的免疫原性,及静脉输注修饰产物对家兔肾、肝、心脏等重要脏器的影响,初步评价了人工改造猪血红蛋白的生物安全性。松弛素家族肽不仅是影响受精、着床、妊娠、分娩、哺乳的重要生殖激素,它还对维持心脏、血管、肾脏和脑的功能起重要作用,它可能还与某些肿瘤的发生有关。全面阐明这类激素的生物学功能及其作用机理对相关疾病的治疗和药物开发具有极其重要的意义。通过基因克隆手段表达激素受体是研究受体-配体作用机制和筛选相应药物的新思路。通过基因重组手段对松弛素受体蛋白进行改造：将松弛素家族肽受体1（RXFP1）或松弛素家族肽受体2（RXFP2）的胞外域与T细胞表面抗原CD8的基因片段重组装入质粒pcDNA3.1/zeo,后者转染HEK293T细胞,通过筛选培养获得RXFP1胞外域（即7BP）和CD8融合蛋白的表达细胞株,以及（RXFP2）胞外域（即8BP）和CD8融合蛋白的表达细胞株。经放射性配体结合试验表明,7BP转染细胞表面具有与H2和H3松弛素高度亲和的结合位点,与报道的RXFP1特征相似；而8BP转染细胞表面呈现与胰岛素样肽-3（INSL3）高度亲和的结合位点,它与H2松弛素也有较高的亲和性,但几乎不结合H3松弛素,这些都符合RXFP2的特征。以上结果表明,两种受体胞外域都已正确锚定在转染细胞表面。在受体蛋白胞外域的N端设计FLAG标签,在胞外域蛋白与T细胞表面抗原CD8跨膜域之间设计凝血酶切割位点。稳态转染细胞在含5 IU/ml凝血酶的无血清培养基中培养3天后,可从培养液中获得从细胞表面酶切下的7BP或8BP蛋白。通过Ni螯合Sepharose和FLAG亲合色谱分离纯化,获得纯7BP或8BP蛋白。33P-释放素的交联实验表明,可溶性纯7BP保留结合松驰素的性能。纯化的7BP蛋白能特异性抑制由松驰素引发细胞内cAMP水平上升的现象。这表明7BP是良好的RXFP1的功能拮抗物。利用7BP蛋白的FLAG亲和末端,将7BP固定在蛋白芯片表面,以固定化7BP蛋白芯片和SELDI-MS分析技术为基础,初步建立了一个可筛选特异性配体的BP蛋白芯片分析系统。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 人工改造血红蛋白及血液代用品的研究进展
• 1.1 前言
• 1.2 血红蛋白的生理功能
• 1.2.1 血红蛋白的携氧功能
• 1.2.2 波尔效应
• 1.3 以血红蛋白为基础的血液代用品
• 1.3.1 直接以血红蛋白为血液代用品
• 1.3.2 以人工改造血红蛋白为血液代用品的研究
• 1.3.2.1 人工改造调整血红蛋白的氧亲和性
• 1.3.2.2 人工改造抗血红蛋白解聚
• 1.3.2.3 人工改造提高血红蛋白的分子大小
• 1.4 血红蛋白携氧能力的评价
• 1.4.1 氧亲和力
• 1.4.2 亚基间协同性
• 1.4.3 血红素铁的价态
• 1.5 血红蛋白类血液代用品的安全性评价
• 1.5.1 对凝血性能的影响分析
• 1.5.2 对免疫系统的影响分析
• 1.5.3 对肾功能的影响评价
• 1.5.4 对血液动力学的影响分析
• 1.6 血液代用品研究中存在的问题
• 1.7 本课题的研究目的和目标
• 第二章 无基质猪血红蛋白的制备及其性能
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 主要仪器
• 2.2.1.2 主要试剂
• 2.2.2 主要方法
• 2.2.2.1 无基质猪血红蛋白的提取和纯化
• 2.2.2.2 氧解离曲线、半饱和氧分压、希尔系数的测定
• 2.2.2.3 猪血红蛋白浓度的测定
• 2.2.2.4 高铁血红蛋白含量的测定
• 2.2.2.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 2.2.2.6 pH等电聚焦电泳分析
• 2.2.2.7 猪血红蛋白的保存稳定性实验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 无基质猪血红蛋白的理化性质和氧结合特性
• 2.3.2 无基质猪血红蛋白的电泳分析
• 2.3.3 IHP对猪血红蛋白的别构调节效应分析
• 2.3.4 冻融及保护剂对猪血红蛋白储存稳定性的影响
• 第三章 小分子化合物修饰猪血红蛋白的条件及其性能
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 试剂
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 猪血红蛋白的理化性能分析（见第二章）
• 3.2.2.2 氧化开环棉子糖的制备
• 3.2.2.3 氧化棉子糖产率的测定
• 3.2.2.4 氧化棉子糖对猪血红蛋白修饰反应条件
• 3.2.2.5 DBBF对猪血红蛋白修饰反应条件
• 3.2.2.6 DBBF修饰猪血红蛋白的条件优化
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 氧化开环棉子糖产率分析
• 3.3.2 氧化棉子糖修饰猪血红蛋白性能分析
• 3.3.2.1 氧化棉子糖修饰猪血红蛋白等电点分析
• 3.3.2.2 氧化棉子糖修饰猪血红蛋白的SDS-PAGE分析
• 3.3.2.3 氧化棉子糖修饰猪血红蛋白的携氧性能分析
• 3.3.3 DBBF修饰猪血红蛋白条件及其性能分析
• 3.3.3.1 脱氧与氧合状态对DBBF修饰猪血红蛋白性能的影响
• 3.3.3.2 反应时间对DBBF修饰猪血红蛋白的影响
• 3.3.3.3 DBBF浓度对DBBF修饰猪血红蛋白的影响
• 3.3.3.4 别构效应调节剂对DBBF修饰猪血红蛋白的影响
• 第四章 聚乙二醇大分子化猪血红蛋白
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.2.2.1 mPEG的活化方法
• 4.2.2.2 mPEG修饰猪血红蛋白的反应条件
• 4.2.2.3 mPEG修饰DBBF内交联猪血红蛋白
• 4.2.2.4 mPEG修饰猪血红蛋白的反应条件优化
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 mPEG活化程度分析
• 4.3.2 mPEG修饰猪血红蛋白
• 4.3.3 mPEG修饰DBBF内交联猪血红蛋白
• 4.3.4 mPEG修饰DBBF内交联猪血红蛋白的条件优化
• 4.3.4.1 反应时间的影响
• 4.3.4.2 反应pH的影响
• 4.3.4.3 反应温度的影响
• 4.3.4.4 PEG与血红蛋白浓度比的影响
• 第五章 人工改造猪血红蛋白的生物安全性分析
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要仪器
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 抗血清的制备
• 5.2.4 酶联免疫吸附实验
• 5.2.5 静脉注射血红蛋白修饰产物的动物试验
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 血红蛋白免疫家兔的抗体水平分析
• 5.3.2 静脉注射猪血红蛋白修饰产物对家兔脏器生化指标的影响
• 第六章 松弛素家族肽及其受体的研究进展
• 6.1 引言
• 6.2 松弛素及松弛素家族肽
• 6.3 松弛素的结构
• 6.4 松驰素的生物学功能
• 6.4.1 松驰素的生殖系统效应
• 6.4.2 松弛素是心血管系统相关激素
• 6.5 松弛素家族肽受体及其研究进展
• 6.5.1 G蛋白偶联受体
• 6.5.2 RLX和胰岛素等激素的作用机制
• 6.5.3 富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体
• 6.5.4 松弛素家族肽受体
• 6.5.4.1 RXFP1和RXFP2的特性
• 6.5.4.2 小肽样RXFP（RXFP3和RXFP4）的特征
• 6.5.4.3 受体的进化
• 6.5.4.4 受体保守性
• 6.5.4.5 RXFPs的遗传功能
• 6.5.4.6 受体分布
• 6.5.4.7 RXFP1和RXFP2的剪接变异体
• 6.5.4.8 受体的结构
• 6.5.4.9 RXFP1和RXFP2受体的结合特性
• 6.5.4.10 RXFP3和RXFP4受体的结合特性
• 6.5.4.11 RXFP受体激活的信号转导机制
• 6.6 松弛素及其受体研究的意义及本课题的目标
• 第七章 BP蛋白表达系统的构建
• 7.1 引言
• 7.2 材料和方法
• 7.2.1 主要仪器
• 7.2.2 主要试剂
• 7.2.3 实验方法
• 7.2.3.1 7BP和8BP蛋白重组质粒的构建
• 7.2.3.2 分光光度法分析DNA浓度和纯度
• 7.2.3.3 1%或1.5%琼脂糖凝胶电泳
• 7.2.3.4 酚法提取DNA
• 7.2.3.5 DNA胶回收法
• 7.2.3.6 DNA末端脱磷反应
• 7.2.3.7 连接反应
• 7.2.3.8 酒精沉淀提纯DNA
• 7.2.3.9 感受态细胞的制备
• 7.2.3.10 电转化感受态细胞
• 7.2.3.11 菌种保存
• 7.2.3.12 小量制备DNA
• 7.2.3.13 大量制备重组质粒
• 7.2.3.14 DNA序列分析
• 7.2.3.15 HEK293T细胞的培养
• 7.2.3.16 细胞活化
• 7.2.3.17 传代培养
• 7.2.3.18 液氮保存细胞
• 7.2.3.19 多聚赖氨酸包被
• 7.2.3.20 非稳态转染细胞的制备
• 7.2.3.21 液体闪烁计数器计数
• 7.2.3.22 表面受体与配体的结合试验
• 7.2.3.23 24孔细胞培养板结合试验
• 7.2.3.24 6孔细胞培养板的结合试验
• 7.3 结果与讨论
• 第八章 BP蛋白的分离纯化及其性能
• 8.1 引言
• 8.2 材料和方法
• 8.2.1 主要仪器
• 8.2.2 主要试剂
• 8.2.3 实验方法
• 8.2.3.1 HEK293T细胞的活化、传代培养及保存
• 8.2.3.2 稳态转染细胞的制备
• 8.2.3.3 稳态细胞表达BP蛋白
• 8.2.3.4 BP蛋白的分离纯化
• 8.2.3.5 配体-受体交联试验（cross-linking test）
• 8.2.3.6 细胞培养板上的交联试验
• 8.2.3.7 BP与RLX的进一步交联试验（Further Cross linking）
• 8.2.3.8 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 8.2.3.9 用干胶机制备凝胶电泳的干胶片
• 8.2.3.10 免疫蛋白印迹分析
• 8.2.3.11 蛋白质含量测定
• 8.2.3.12 固相合成短肽Flag
• 8.2.3.13 胞内cAMP的检测
• 8.3 结果与讨论
• 8.3.1 稳态转染细胞结合特征
• 8.3.2 7BP蛋白的纯化和交联试验
• 3.3.3 FLAG肽的合成
• 8.3.4 BP蛋白对RLX细胞效应的阻断实验
• 第九章 BP蛋白芯片的构建及其性能分析
• 9.1 引言
• 9.2 材料与方法
• 9.1.1 主要仪器和试剂
• 9.1.2 基本方法
• 9.1.2.1 芯片预处理和上样
• 9.1.2.2 芯片检测、数据采集和参数设置
• 9.1.2.3 SELDI-MS分析7BP
• 9.1.2.4 固定化7BP蛋白芯片捕获相应配体的试验
• 9.3 结果与讨论
• 9.3.1 BP蛋白在芯片上的固定化
• 9.3.2 固定化7BP的蛋白芯片对配体-松弛素的捕获性能
• 参考文献
• 致谢