人皮肤成纤维细胞诱导多潜能干细胞的研究

论文摘要

目的：通过异位表达某些转录因子,可以将体细胞重编程成诱导性多潜能干细胞（iPSCs）,它能避开ES细胞带来的伦理问题,减少免疫排斥,给自体化干细胞基因治疗的临床应用提供了可能性,为遗传性疾病体外研究提供了一个很好的平台。方法：目前有多种方法可诱导获得iPS细胞,包括利用各种病毒载体、纯化的重组蛋白质、修饰的RNA分子等。同时研究发现多种小分子化合物也可促进iPS的产生,如Vc能加速基因表达水平的改变,促进前体iPS细胞转变成完全重编程的iPS细胞；VPA在重编程过程中,可上调ES特异性基因的表达,下调MEF特异性基因的表达。在本研究中,我们利用逆转录病毒介导的转染系统将Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4这4个转录因子导入人皮肤成纤维细胞（HDF）,同时在诱导过程中添加Vc和VPA,最终获得iPS细胞。然后,通过TRA-1-60/TRA-1-81活细胞染色,机械法挑取阳性克隆传代培养。采取形态学、碱性磷酸酶染色以及干细胞表面多潜能标志物染色的方法对传代后的克隆进行初步鉴定。结果：（1）用脂质体Lipofectamine2000将逆转录病毒载体及包装质粒共同转染293T细胞,可获得较高质量的逆转录病毒；（2）诱导出的克隆在形态上与hES细胞相似,外源基因GFP不表达,经过活细胞染色发现其TRA-1-60/TRA-1-81有表达,挑取上述克隆传代后,AP染色结果呈阳性,ES细胞表面标志免疫荧光检测呈阳性。传至P7代,仍然具有ES样克隆形态。结论：利用逆转录病毒系统将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞,经初步鉴定可表达多潜能性表面标志物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 前言
• 1 实验材料
• 1.1 实验仪器
• 1.2 实验试剂、耗材
• 1.3 实验中应用到的相关质粒
• 1.4 细胞系
• 1.5 主要试剂配制
• 2 实验方法
• 2.1 MEF细胞的分离培养
• 2.2 分离后的MEF细胞检测支原体
• 2.3 丝裂霉素C处理MEF细胞
• 2.4 293T包装细胞的准备
• 2.5 质粒转染293T细胞
• 2.6 收集病毒,感染HDF细胞
• 2.7 感染后细胞的诱导培养
• 2.8 对形成的克隆活细胞染色
• 2.9 克隆的挑取、维护和扩大培养
• 2.10 FiPS克隆的冻存
• 2.11 碱性磷酸酶检测
• 2.12 FiPS细胞表面标志物的检测
• 3 结果
• 3.1 MEF细胞支原体检测结果
• 3.2 脂质体Lipofectamine2000转染293T细胞
• 3.3 病毒悬液感染HDF细胞
• 3.4 病毒感染后ES样克隆的形成
• 3.5 TRA-1-60活细胞染色检测结果
• 3.6 TRA-1-81活细胞染色检测结果
• 3.7 HDF细胞重编程为iPS细胞的形态
• 3.8 碱性磷酸酶检测结果
• 3.9 FiPS细胞表面标志免疫荧光检测结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述
• 诱导的多潜能性:历史、机制和应用
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间主要研究成果