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南方红豆杉中内共生真菌的分离、鉴定及耦合培养初探

2020-11-23阅读(723)

南方红豆杉中内共生真菌的分离、鉴定及耦合培养初探

论文摘要

为研究内共生真菌（endofungus）和其宿主的关系,自南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）中分离了1000余株内共生真菌,并做了初步分类鉴定。主要内共生真菌分布于以下属:围小丛壳菌属Glomerella sp.、葡萄痕孢属Botryoderma sp.、葡萄孢属Botrytis sp.、头孢霉属Cephalosporium sp.、青霉属Penicillium sp.、曲霉属Aspergillus sp.、轮生菌属Verticillium sp.、桶孢属Amblyosporium sp.、木霉属Trichoderma sp.、厚壁孔孢属Gilmastix sp.、无色芽枝霉属Hyalodendron sp.、拟茎点霉属Phomopsis sp.、粘鞭霉属Gliomastix sp.、镰刀菌属Fusarium sp.、线壳囊孢属Cytosporira sp.、小白壳囊孢属Cytosporella sp.、疱霉属Phoma sp.、刺盘孢属Colletotrichum sp.、散囊菌属Eurotium sp.、黑曲霉属Aspergillus sp.、链毛孢属Stroptothrix sp.、黑团孢属Periconia sp.、支链孢属Alternaria sp.、圆砖孢属Vlocladium sp.、树粉孢属Oidiodendron sp.、向基孢属Basipetosrium sp.等。优势属为镰刀菌属。得到了9株能产紫杉醇的内共生真菌,以菌株Y1117的产量性状最高,针对Y1117进行了菌种的系统鉴定,包括产物产量鉴定、形态学鉴定和分子生物学（18S rDNA、Internal transcribed spacer、β-tubulin gene）鉴定,确定其为从南方红豆杉中分离得到的一株能产紫杉醇的Fusarium属新种,暂定名为美丽镰刀菌（Fusarium mairei Cheng L. et Tao WY.）。本菌株已申请专利,申请号:200510038424.8,本专利已公开,公开号:CN1670180A。针对菌种筛选和菌种改良,进行了高通量筛选的研究,得到较优的筛选条件为:玻璃纸平板培养5天,菌丝体50°C真空干燥5h,乙醇-氯仿（1:1）混合溶剂浸提2h,重复3次,HPLC/MS检测。考虑到实验安全等因素,采用上述条件,以甲醇-二氯甲烷（1:1）混合溶剂代替乙醇-氯仿混合溶剂为高通量筛选的方案。针对内共生真菌培养过程中紫杉醇的检测方法进行了验证和改良,认为,快速准确地分析菌丝体或发酵液中的紫杉醇,同时又能消除其它结构类似物的影响,HPLC/MS是一个较好的选择。利用取得自主知识产权的耦合式生物反应器对F. mairei和东北红豆杉（T. cuspidata）细胞进行了耦合培养,发现耦合培养时无论是植物细胞还是微生物细胞的紫杉醇产量均有不同程度地提高,生长曲线和代谢曲线也有所变化,并对此现象作了初步分析,为进一步研究内共生真菌的植物宿主之间的具体作用物质和作用原理打下了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪言
  • 1.1 紫杉醇
  • 1.1.1 药理
  • 1.1.2 毒理
  • 1.2 红豆杉
  • 1.3 紫杉醇的生产现状
  • 1.3.1 全合成和结构修饰
  • 1.3.2 半合成
  • 1.3.3 植物细胞培养
  • 1.3.4 微生物方法
  • 1.4 内共生真菌生产紫杉醇 .
  • 1.4.1 内共生真菌
  • 1.4.2 内共生真菌中的活性物质
  • 1.4.3 内共生真菌的鉴定
  • 1.4.4 内共生真菌与宿主的关系
  • 1.4.5 内共生真菌生产紫杉醇
  • 1.5 紫杉醇的检测
  • 1.5.1 TLC
  • 1.5.2 HPLC .
  • 1.5.3 HPLC
  • 1.5.4 免疫学方法
  • 1.5.5 毛细管电泳法
  • 1.5.6 细胞生物学方法（Bioassay）
  • 1.5.7 其它 .
  • 1.6 本课题的主要研究内容 .
  • 1.7 参考文献
  • 第二章内共生真菌筛选和植物细胞培养
  • 2.1 前言 .
  • 2.1.1 内共生真菌的分离
  • 2.1.2 红豆杉细胞悬浮培养
  • 2.2 材料与方法
  • 2.2.1 仪器、试剂和培养基配方 .
  • 2.2.2 植物外植体的采集
  • 2.2.3 内共生真菌的分离 .
  • 2.2.4 内共生真菌的液体培养
  • 2.2.5 生物量测定
  • 2.2.6 愈伤组织诱导
  • 2.2.7 紫杉醇含量测定
  • 2.3 结果
  • 2.3.1 内共生真菌的分离
  • 2.3.2 植物愈伤组织的诱导
  • 2.4 本章小结 .
  • 2.5 参考文献
  • 第三章 Y1117 的分类鉴定
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 菌株
  • 3.1.2 仪器、试剂和培养基配方
  • 3.1.3 产物鉴定
  • 3.1.4 形态学鉴定
  • 3.1.5 分子生物学鉴定
  • 3.2 结果
  • 3.2.1 产物鉴定
  • 3.2.2 形态学鉴定
  • 3.2.3 分子生物学鉴定
  • 3.3 讨论
  • 3.4 结论
  • 3.5 本章小结
  • 3.6 参考文献
  • 第四章 快速检测方法研究
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 材料
  • 4.1.2 仪器、试剂和培养基配方
  • 4.1.3 TLC
  • 4.1.4 HPLC
  • 4.1.5 HPLC
  • 4.1.6 毛细管电泳 .
  • 4.1.7 ELISA
  • 4.2 结果与讨论
  • 4.2.1 TLC
  • 4.2.2 HPLC
  • 4.2.3 HPLC
  • 4.2.4 毛细管电泳
  • 4.2.5 ELISA
  • 4.3 本章小结
  • 第五章 高通量筛选
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 材料
  • 5.1.2 仪器、试剂和培养基配方
  • 5.1.3 方法
  • 5.2 结果和讨论
  • 5.2.1 溶剂的极性
  • 5.2.2 提取得率
  • 5.2.3 不同溶剂对F. mairei 菌丝体紫杉醇提取的影响
  • 5.3 本章小结
  • 5.4 参考文献
  • 第六章 耦合培养
  • 6.1 前言
  • 6.2 材料与方法
  • 6.2.1 材料
  • 6.2.2 仪器、试剂和培养基配方
  • 6.2.3 方法
  • 6.3 结果
  • 6.3.1 东北红豆杉悬浮细胞单独培养
  • 6.3.2 F. mairei 单独培养
  • 6.3.3 耦合培养紫杉醇的产量变化
  • 6.3.4 耦合培养F. mairei 培养液中紫杉醇的产量变化
  • 6.3.5 耦合培养过程中物质的变化
  • 6.4 讨论
  • 6.4.1 紫杉醇的产量
  • 6.4.2 紫杉醇的外泌
  • 6.4.3 两种细胞的共生关系
  • 6.4.4 两种细胞的相互作用
  • 6.4.5 “新物质”的生成
  • 6.4.6 “新物质”的性质
  • 6.4.7 负效应物
  • 6.4.8 MS 的灵敏度
  • 6.5 本章小结
  • 6.6 参考文献
  • 第七章 附录
  • 7.1 HPLC
  • 7.2 植物鉴定报告
  • 7.3 Fusarium mairei 18S rDNA 基因序列
  • 7.4 Fusarium mairei ITS 基因序列
  • 7.5 Fusarium mairei β-tubelin 基因序列
  • 论文工作总结与展望
  • 取得成果和创新点
  • 致谢
  • 发表论文

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