猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗的研究

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变的高度接触性传染病。自1957年Pattison首次报道本病以来,该病在世界范围内广泛流行,并给各国养猪业带来了严重的经济损失。由于APP极易产生耐药性,疫苗接种是防控本病的主要措施。目前,国内主要使用灭活疫苗预防和控制本病。但由于APP血清型较多,灭活疫苗的保护效果十分有限。因此,开发新型疫苗已经成为研究热点。研究表明,通过分子生物学手段构建的一些PCP弱毒疫苗和新兴起的一种ghosts疫苗较灭活疫苗的免疫保护效果有明显提高,但这两种疫苗也存在一些问题,弱毒疫苗随着毒力降低,其免疫原性也有所降低,且存在毒力返强的可能性,而ghosts疫苗则存在菌体裂解不彻底等缺点。以天然提取的APP毒力因子为组份的亚单位疫苗则不存在上述缺点,且这种疫苗能诱导产生很好的免疫保护,但就其制备方法而言,存在着提取成本高、产量低和不适于大量生产等缺点。鉴于此,本试验通过基因工程方法,重组表达APP的多种毒力因子,制备多组份重组亚单位疫苗,并进行了免疫保护效果的探讨。研究表明,APP分泌的外毒素（ApxI、ApxII、ApxIII）和外膜蛋白（OMP）等不仅是APP重要的毒力因子,同时也是重要的免疫原性因子,它们已经作为4种重要的候选抗原应用于APP亚单位疫苗的研究,但APP菌毛（ApfA）和最近发现的的外毒素IV（ApxIV）作为APP的另外两个重要毒力因子,尚未见其应用于亚单位疫苗的研究报道。根据ApfA在定居宿主细胞过程中发挥的重要作用及ApxIV能刺激机体产生较高的抗体水平这一点,推测二者可能会在交叉保护方面起促进作用。因此,本试验首次将Apfa和ApxIV也作为疫苗组份进行了研究,并首次制备以4种和6种重组蛋白为组份的重组亚单位疫苗,通过对BALB/c小鼠的免疫攻毒保护试验,与灭活疫苗进行了保护效力的比较。具体试验内容与结果如下:1采用PCR方法分别从APP2型S1536株、APP1型72-1株和APP7型25-4株中扩增到APP的重要保护性抗原基因apxⅢA（3114bp）,apxIVA（2553bp）和omp（963bp）。序列测定后与GenBank发表的其他菌株进行同源性比较。结果表明,所扩增的apxⅢA基因与血清2型和血清8型405株的核苷酸同源性分别为98.4%和97.8%,氨基酸同源性分别为98.9%和97.1% ;apxIVA基因与血清1型4074株和3型HV114株的核苷酸同源性分别为99.9%和99.2%;氨基酸同源性分别为99.9%和98.9%;omp基因与血清3型S1421株、血清6型Femo株和血清7型WF83株的核苷酸同源性分别为98.3%、98.2%和100%,氨基酸同源性分别为98.8%、98.8%和100%。以上结果说明所扩增的目的基因在不同血清型之间非常保守,尤其是apxIVA和omp基因。2成功构建了重组表达载体pGEX-apxⅢA,pGEX- apxⅣA和pGEX-omp。并将6种重组表达载体pGEX-apxⅢA,pGEX- apxⅣA、pGEX-omp、pGEX-apxIA、pGEX-apxⅡA和pGEX-apfa（后三种为实验室已经构建好）分别在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,获得6种重组蛋白GST-Apx（IrApxI）、GST-ApxⅡ（rApxⅡ）、GST-ApxⅢ（rApxⅢ）、GST-ApxⅣ（rApxⅣ）、GST-Apfa（rApfa）和GST-OMP（rOMP）,大小分别约116、110、140、118、42和62Ku。Western-blot分析表明,6种重组蛋白具有良好的抗原性。3将rApxI、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP组合作为疫苗I组,rApxI、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxⅣ、rApfa和rOMP组合作为疫苗Ⅱ组,APP1型菌制备的灭活疫苗作为疫苗Ⅲ组,PBS

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 猪传染性胸膜肺炎的流行与危害
• 1.1.1 病原学
• 1.1.2 流行病学
• 1.1.3 临床症状和病理变化
• 1.1.4 实验室诊断方法
• 1.2 胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子研究进展
• 1.2.1 外毒素
• 1.2.2 外膜蛋白
• 1.2.3 荚膜多糖
• 1.2.4 脂多糖
• 1.2.5 转铁结合蛋白
• 1.2.6 菌毛
• 1.2.7 其他毒力因子
• 1.3 猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展
• 1.3.1 灭活疫苗
• 1.3.2 弱毒活疫苗
• 1.3.3 Ghosts 疫苗
• 1.3.4 亚单位疫苗
• 1.4 研究目的及意义
• 1.5 主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒与菌株
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 抗体
• 2.1.4 试验动物
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 培养液及培养基
• 2.1.7 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 胸膜肺炎防线杆菌的PCR 鉴定
• 2.2.2 基因的克隆与序列测定
• 2.2.3 重组表达载体的构建
• 2.2.4 目的基因在大肠杆菌中的表达及纯化
• 2.2.5 Western-blot 分析6 种重组蛋白的抗原性
• 2.2.6 疫苗的制备
• 2.2.7 免疫及攻毒
• 2.2.8 攻毒后小鼠肺脏病理变化
• 2.2.9 间接免疫荧光进行肺脏的抗原定位试验
• 2.2.10 血清特异性抗体的检测
• 2.2.11 脾淋巴细胞转化试验及脾脏诱生的IL-2 的检测
• 2.2.12 数据处理
• 3 结果
• 3.1 胸膜肺炎放线杆菌PCR 鉴定结果
• 3.2 目的基因的克隆与序列测定结果
• 3.2.1 目的基因的PCR 扩增
• 3.2.2 重组质粒的酶切鉴定
• 3.2.3 目的基因的序列分析
• 3.3 重组表达质粒的酶切鉴定
• 3.4 SDS-PAGE 电泳分析6 种重组蛋白
• 3.5 Western-blot 分析6 种重组蛋白的抗原性
• 3.6 SDS-PAGE 电泳鉴定天然提取的胸膜肺炎放线杆菌的5 种毒力因子
• 3.7 免疫攻毒后保护情况
• 3.7.1 LD50 的确定
• 3.7.2 攻毒后临床症状及死亡情况
• 3.7.3 肺脏解剖学病变
• 3.7.4 肺脏组织学病变
• 3.8 免疫鼠血清特异性抗体的动态变化
• 3.8.1 ApxI 抗体
• 3.8.2 ApxII 抗体
• 3.8.3 ApxIII 抗体
• 3.8.4 Apfa 抗体
• 3.8.5 OMP 抗体
• 3.9 免疫鼠脾淋巴细胞转化的动态变化
• 3.10 免疫鼠脾淋巴细胞诱生IL-2 的动态变化
• 3.11 间接免疫荧光检测结果
• 4 讨论
• 4.1 关于胸膜肺炎放线杆菌菌株的鉴定
• 4.2 关于目的基因的克隆与序列测定
• 4.3 关于目的基因的表达及抗原反应原性检测
• 4.4 关于目的基因克隆过程中遇到的问题
• 4.5 关于猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗的设计思路
• 4.6 关于重组亚单位疫苗对BALB/c 小鼠的保护作用
• 4.7 关于重组亚单位疫苗对体液免疫反应的影响
• 4.8 关于重组亚单位疫苗对细胞免疫的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 附录C
• 附录D
• 附录E
• 附录F
• 攻读博士期间发表的学术论文