论文摘要
感光细胞遗传性疾病在临床上比较常见，如视网膜色素变性、视锥-视杆营养不良和Leber先天性黑矇等。这类疾病在诊断上比较容易，但是目前都没有有效的治疗方法，虽然发现了许多致病基因，但是其确切的致病机制仍然不很清楚。为了确切了解这类疾病的致病机制和寻找最佳的治疗方法，好的动物模型非常重要。模式生物是研究基因功能的一种新型的研究方法，斑马鱼胚胎透明、体外发育、个体小、繁殖率高、产卵时间长、以及鱼种发育遗传背景清晰等优点使其正成为研究脊椎动物发育生物学、发育遗传学的理想模式生物。斑马鱼属于脊椎动物，其心血管、血液、消化道、肝脏、肾脏以及视觉系统与人类相应系统有许多共同特点。用该模型阐明早期发育、器官形成、系统生理学、药理学和复杂疾病等问题均切实可行。其视网膜与哺乳动物包括人类的结构非常相似，分层排列，包括神经视网膜和视网膜色素上皮层，神经视网膜有特征性的3层细胞层，7种主要细胞，包括6种神经元和Müller’s胶质细胞。其感光细胞与人类具有相似的形态学特点，有胞体和盘状的外节段。这使得斑马鱼成为感光细胞发育生物学研究的重要模式动物之一，极大地推动感光细胞疾病发病机制的研究。CRX基因最早发现于1997年，是第一个被发现的感光细胞特异性等位转录因子，定位在19q13.3上。在哺乳动物中，CRX基因在发育中和成熟的视杆、视锥细胞中高表达，内核层的外层弱表达，在松果体中也有表达。CRX蛋白识别许多位于感光细胞特异基因启动子区的DNA序列TAATCC／A，如编码视紫质的基因、视杆细胞cGMP磷酸二酯酶β亚单位、感光细胞间视色素连接蛋白等，结合并激活这些基因的促进子。CRX蛋白可能参与调控与感光细胞有关的基因表达，CRX基因突变会阻断蛋白质在感光细胞核内的传送。在斑马鱼中也发现CRX基因，在视网膜的感光细胞和松果体有表达。CRX因突变可导致常染色体显性视锥-视杆细胞营养不良、迟发型视网膜色素变性和先天性黑朦等多种临床表型。2000年，Nasevicius等提出了注射吗啡啉修饰性寡核苷酸可获得基因表达下调的斑马鱼。吗啡啉有抑制翻译的起始，减少传统反义寡核苷酸非特异性的效应。注射吗啡啉能够产生以往证实的基因突变的拟表型，有助于确定未知功能的基因。吗啡啉寡核苷酸正在成为快速、高效的基因敲除方法，使经典反向遗传学方法应用于斑马鱼。视黄酸是小分子、脂溶性形态形成信号分子，来源于维生素A，是中枢神经系统包括视网膜正常发育所必须的。正常发育的斑马鱼，腹部视网膜的RA丰富，视杆和视锥细胞的分化强烈，表明RA信号系统在视杆、视锥的分化成熟中和眼球早期发育起作用。有研究表明视黄酸可以促进感光细胞的发育。第一部分斑马鱼幼鱼视网膜和感光细胞发育的研究目的研究斑马鱼视网膜和感光细胞的发育，明确利用斑马鱼研究视网膜和感光细胞的可行性。材料和方法制备斑马鱼视网膜感光细胞视蛋白Rho、SWS1和SWS2的RNA探针。收集受精后72、96和120小时的斑马鱼幼鱼进行眼球组织切片和整体原位杂交。结果1．72hpf，斑马鱼的神经视网膜分层排列，包括3个细胞层和2个丛状层，由外到内分别是感光细胞层，外丛状层，内核层，内丛状层和神经节细胞层。96hpf和120hpf，视网膜3个细胞层的细胞排列更加整齐，感光细胞的外节段发育更加成熟，更加明显，外丛状层和内丛状层增宽，表明神经细胞之间的突触连接进一步增加。晶体和视网膜之间开始有玻璃体腔形成。2．72hpf，斑马鱼感光细胞的视蛋白有表达，其中视杆细胞Rho视蛋白的表达范围大于视锥细胞的SWS1和SWS2视蛋白。3种表达的视蛋白主要都集中在鼻侧视网膜。96hpf，3种视蛋白的表达进一步增强，在视网膜的表达范围扩大。120hpf，整个视网膜都有3种视蛋白的表达。结论利用斑马鱼进行视网膜和感光细胞的研究是可行的。第二部分视锥-视杆同源盒基因（cone-rod homeobox gene，CRX）表达下调对斑马鱼感光细胞发育的影响目的观察斑马鱼受精卵CRX基因表达下调后，视网膜感光细胞外节段的发育和视蛋白的表达。材料和方法在斑马鱼受精卵内显微注射CRX-MOs，使CRX基因的表达下降。通过斑马鱼眼球的组织学切片、电镜标本和视蛋白RNA探针的原位杂交观察感光细胞以及外节段的发育和视蛋白的表达。结果1．CRX基因表达下调后斑马鱼的表型没有明显异常。2．视网膜组织切片观察，CRX组与对照组、空白组比较，72hpf和96hpf，视网膜和感光细胞的发育都没有明显差别。3．72hpf，电镜观察，对照组和空白组斑马鱼的感光细胞都有外节盘形成，层状结构清晰，但是CRX组未发现明显的外节盘结构。96hpf，对照组和空白组感光细胞的外节盘均增长，CRX组开始有外节盘形成，但比对照组和空白组均小。4．72hpf，对照组和空白组斑马鱼均可在鼻侧视网膜区域观察到Rho、SWS1和SWS2三种视蛋白的表达，CRX组3种视蛋白的表达明显减少。96hpf，对照组和空白组3种视蛋白的表达进一步增强，范围扩大，CRX组视蛋白表达比72hpf有所增加，但仍然明显少于96hpf的对照组和空白组。结论CRX基因影响感光细胞外节段的发育和视蛋白的表达。第三部分全反式视黄酸对CRX基因表达下调的斑马鱼感光细胞的保护作用目的观察加入外源性全反式视黄酸后，能否促进CRX基因表达下调的斑马鱼感光细胞外节段的发育和视蛋白的表达。材料和方法斑马鱼受精卵显微注射CRX—MOs后，在48hpf，胚胎培养液中加入1×10-7Mol/L的全反式视黄酸溶液，对照组加入相同浓度的全反式视黄酸溶剂，通过眼球的组织切片、电镜和整体原位杂交观察感光细胞以及外节段的发育和视蛋白的表达。结果1．72hpf，对照组、CRX组和CRX+RA组的表型没有明显差异；96hpf，CRX+RA组的斑马鱼身体有水肿。2．光镜下，各组的视网膜组织切片观察没有明显差异。3．电镜下，对照组72hpf，感光细胞有外节盘形成，层状结构清晰；CRX组未发现明显的外节盘结构；CRX+RA组的感光细胞有许多外节盘形成，结构清晰，且外节盘的体积较大。4．受精后72小时，对照组的视网膜部位可观察到Rho、SWS1和SWS2三种视蛋白的表达；CRX组这三种视蛋白的表达明显减少；CRX+RA组三种视蛋白的表达比CRX组明显增加，基本达到对照组的水平。结论全反式视黄酸能促进CRX基因表达下调的斑马鱼感光细胞外节段的形成和视蛋白的表达。
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相关论文文献
- [1].CRX在颅外恶性小圆细胞肿瘤中的免疫组化表达(英)[J]. 诊断病理学杂志 2013(03)
- [2].多氯联苯暴露对斑马鱼视网膜形态学及CRX基因表达的影响[J]. 中国儿童保健杂志 2010(12)
- [3].OTX2和CRX调控视网膜光感受器细胞发育分化的研究进展[J]. 眼科新进展 2015(03)