胃癌前期病变监测关键技术研究及热休克蛋白表达意义探讨

论文摘要

在全球范围恶性肿瘤中，胃癌病死率排列第二，我国是胃癌的高发区。胃癌的病因至今不明，但绝大多数的学者认为胃癌的发生与遗传、幽门螺杆菌感染及胃癌前期病变等因素相关。根据Lauren分类，非贲门区的胃癌从组织学上可分为肠型胃癌和弥漫型胃癌。肠型胃癌由胃癌前期病变发展而来。胃癌前期病变中最多见且关系最密切的就是慢性萎缩性胃炎。Correa P提出的假说即“从正常胃黏膜到浅表性胃炎到萎缩性胃炎到肠上皮化生到异型增生直至肠型胃癌”已被越来越多的人所接受。在慢性浅表性炎症中，一部分发展为弥漫性胃窦部胃炎，另一部分发展为多灶性萎缩性胃炎。而多灶性萎缩性胃炎与肠上皮化生，异型增生以及肿瘤相关。多灶性萎缩性胃炎从开始就是累及全胃的浅表性炎症，呈点状分布。点片状的病灶之间互不相关，轻重不等。因此要监测胃癌前期病变需要依靠病理学的准确诊断。目前的随机活检技术因取材部位的不同而造成病理诊断的差异，不能对胃癌前期病变做出准确合理的诊断。胃癌前期病变发展为胃癌是一个相对较长的过程，为了能实现胃癌的早期诊断就需要对胃癌前期病变进行长期随访。而监测中的准确定位是实现长期随访的关键。由此设想采用一种技术在活检病灶的同时对病灶进行定标，能使这种标定保持至下一次的检查。依靠这种技术可以科学判断癌前病变，还能使临床早期诊断胃癌及针对性治疗癌前病变。在发生癌变的病理变化过程中，在病理形态学发生改变之前，许多病理生理学指标已经发生改变。在准确定标的基础上有必要探索一个有较高阳性预测值和较高阴性预测值的分子生物学指标，以提高慢性萎缩性胃炎监测的有效性。热休克蛋白（heat shock protein，Hsp）是生物界广泛存在一类高度保守的蛋白质，常态下除参与细胞内一些重要蛋白质分子的构象、稳定性及激酶活性调节之外，还能对多种应激状态下的细胞提供保护，维持细胞稳定性。它能快速、短暂调整应激过程中的细胞机能，保护细胞免受损伤，并有助于细胞恢复正常的结构和机能。Hsp在胃黏膜炎症、萎缩和癌变中的作用近年来也被日益重视。HsD90不仅参与蛋白的运输、解聚以及保护细胞免受环境压力，还可能对肿瘤细胞的增殖和存活起着重要的作用。HSP 60是原核细胞和真核细胞的分子伴侣，主要位于线粒体内，可能参与了肿瘤特殊信号的传递。宫颈癌、大肠癌和前列腺癌中HSP60的表达在肿瘤发生的过程中呈现出逐步上升的规律，特别是在异型增生阶段表达逐步增加直至肿瘤发生。因此将Hsp60和Hsp90作为标志物，探索它们在胃癌前期病变的主要疾病——慢性萎缩性胃炎的表达变化；研究其在癌变过程的作用及能否用作为胃癌前期病变癌变监测的有效指标都有重要意义。探索胃癌癌前病变监测的关键技术和有效指标将为建立准确监测胃癌前期病变癌变体系打下基础。因此，如果前两部分实验获得成功，就为胃癌前期病变癌变监测体系的建立创造了可能。今后在这技术平台上的发展方向是值得我们思考和展望的。§Ⅰ胃癌癌前期病变监测的关键技术——定标活检钳的发明和成功研制一、定标活检钳的医学要求，定标活检钳的研制，定标液的研制本研究部分从胃癌前期病变监测的医学要求出发，提出医学对定标活检钳和定标液的要求并研制定标活检钳。定标活检钳在医学上要求应能通过内镜活检孔道，并具备常规活检钳的功能，还应有注射定标液的功能。定标液必须安全无毒且能长期存在。自行设计、研制，重复三批次产品改进，终于研制出体腔黏膜定标活检钳。该定标活检钳结构上有钳头，钳身和手柄三大部分组成，完全符合医学要求，达到国家技术标准。按定标液的医学要求并参考国内外医学文献，对各种定标液进行筛选，最后选用印度墨汁，并就其使用浓度和剂量进行探索。从定标活检钳的研制，定标液的筛选到动物试验和临床试验，整个过程历时五年半。成功地解决了胃癌前期病变监测的关键技术问题。二、动物试验试验目的：为检验定标活检钳及定标液的性能是否符合医学要求。试验内容：1、定标活检钳的性能：经内镜操作的顺利性，并与传统的活检方法对比，定标活检钳所取活检标本是否能满足病理组织学检查的要求。2、定标液的性能：三种浓度、三种剂量的印度墨汁定标后的可辨认清晰度及可能引起的组织学炎症反应改变情况。结果：定标活检钳与用普通活检钳加内镜注射针相比，单次活检内镜操作时间定标活检钳为40秒，而用传统活检钳为1分10秒。两组共18块组织用于活检效果分析，两组在活检标本的重量、大小、切取深度及满足组织学检查方面均相似（P＞0.05）。定标液浓度以印度墨汁1∶10稀释后每点注射0.5ml为最佳。定标后15个月仍有较好的清晰度，局部炎症反应轻微可忽略。结论：定标活检钳操作性能良好，操作顺利，占用时间较短。定标液用1∶10浓度的印度墨汁0.5ml定标最佳，局部组织无明显改变。三、临床试验：试验目的：为了验证定标活检钳在胃癌前期疾病患者中临床使用的效果，探讨其应用价值。试验内容：，对胃镜下和病理已经确诊的慢性萎缩性胃炎的患者行胃窦小弯、胃窦大弯、胃体小弯、胃体大弯、胃角共5点（印度墨汁1∶10稀释度0.3ml-0.5ml）进行标准定标活检术，根据临床需要作定期随访复查胃镜并行病理学检查。结果：对40例患者在定标活检后3个月至15个月随访，绝大多数患者定标后未出现新的胃肠道不适表现。经药物治疗后已复查的13例，其中12例定标点清晰（一例保持至15个月）。组织学检查未见明显活动性炎症反应，未见异物肉芽肿或坏死性炎症。原有腺体萎缩或肠化病变变化不大，有一例有明显改善（中重度萎缩肠化转变为轻度）。结论：采用定标活检对胃癌前期病变监测可行。1∶10稀释度0.3ml-0.5ml的印度墨汁定标后能保持长时间清晰，所取样本能满足病理检查需要，监测反应良好，未见明显副反应。能够解决胃癌前期病变监测对技术的需要。四、命名定标活检技术（Marking Targeting Biopsy，MTB）申报产品专利和相关产品开发有关MTB技术相关论文发表在中华消化杂志和World Journal of Gastroenterology。发明的定标活检钳获国家发明专利。相关产品两个已开发试生产，同时获国家新型实用专利。§ⅡHsp在胃癌前期疾病和胃癌中的表达和意义探讨鉴于HSP在胃黏膜损伤及细胞凋亡增殖上的特异性作用，我们选择了HSP60和HSP90这两个与癌前期病变可能相关的指标作为我们的研究对象，试图为癌前病变癌变监测寻找高阳性预测价值和阴性预测价值的生物学指标。本部分是通过两个方面来开展实验：一是对不同个体、不同疾病状态分层，观察HSP90和HSP60的普通表达；二是利用定标活检技术准确地对同一个体不同疾病时期随访观察HSP的特征表达。一、Hsp在不同个体不同疾病状态下蛋白和mRNA表达水平的研究。研究目的：探讨HSP90和HSP60这两个分子生物学指标在不同癌前疾病状态即慢性浅表性胃炎，慢性萎缩性胃炎和胃癌时的差异，以确定其在不同癌前状态的预测价值。研究内容：对慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎及胃癌人群分组分层研究，观察HSP90和HSP60在蛋白和mRNA水平的表达。材料与方法：对慢性萎缩性胃炎组的81例患者根据萎缩的轻、中、重程度分层分组，胃癌组59例，慢性浅表性胃炎组51例。HSP60和HSP90蛋白水平用免疫组化和Western-blot两种方法检测，HSP60和HSP90的mRNA表达水平用荧光实时定量PCR检测。结果：慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和胃癌三组在免疫组化结果观察均有HSP90和HSP60的表达。镜下可见胃黏膜皱襞上皮细胞的胞浆内可见棕色的颗粒。各组细胞核中均无阳性表达。HSP90和HSP60表达强度均以胃癌组最强，慢性浅表性胃炎组较弱。HSP60在慢性萎缩性胃炎组表达较慢性浅表性胃炎组高但低于胃癌组，差异有统计学意义。Western-blot结果发现HSP90蛋白在慢性萎缩性胃炎各组中随萎缩加重而降低，胃癌时升高，但在各分组之间表达的差异无统计学意义。HSP60蛋白表达在轻度萎缩的患者中表达升高，随萎缩加重又逐渐减低，但差异无统计学意义。胃癌患者HSP60蛋白表达最高，与慢性浅表性胃炎相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。HSP90mRNA在重度萎缩时下降，胃癌时上升，差异显著，有统计学意义（P＜0.05）。HSP60mRNA在轻度萎缩性胃炎组中表达升高，而胃癌组中表达更高，差异显著，有统计学意义（P＜0.05）结论：HSP60和HSP90可能成为监测慢性萎缩性胃炎转归的生物学指标。当HSP90的表达由低水平向高水平上升时，应警惕增殖异常、癌变的可能。当HSP60的表达上升，提示持续性损害和增殖旺盛。联合监测HSP60和HSP90均表达上升时强烈提示增殖过度有癌变可能。二、采用MTB技术对同一个体胃癌前疾病不同阶段HSP蛋白和mRNA表达变化长期监测的打算和预试验。研究目的：对胃癌前期病变患者长期随访，研究个体的疾病变化各阶段HSP60，HSP90的变化，探讨其预测癌变价值。研究方法：采用MTB技术对胃癌前期病变患者进行内镜下定标活检后长期随访。监测其病理变化的同时对HSP60，HSP90蛋白和mRNA表达作分析，比较不同时期疾病变化及治疗后的转归。结果：作为前瞻性研究的一种长期打算和预试验，目前共有40例患者纳入队列中作长期监测。其中30例有不同程度的肠化，1例有低级别黏膜内瘤变。随访时间3-15个月不等，现已回访患者13例，回访的患者除一例中重度萎缩肠化转变为轻度有明显好转外，其余绝大多数原有病理学上萎缩和肠化程度没有明显改变。所取样本都做了HSP蛋白和mRNA的检测并输入数据库等待今后深入分析。§Ⅲ建立胃癌前期病变癌变准确监测体系的思考和建议胃癌癌前病变监测的关键技术和有效指标都是为了建立胃癌前期病变癌变准确监测体系。由于前两部分的实验取得了成效，今后我们可以应用胃黏膜定标活检技术对同一个体胃癌前期病变组织进行准确定标活检和长期随访，建立群体组织数据库，并联合应用现代分子生物学和生物信息学技术揭示胃癌前期病变癌变病理转归模式及相应分子事件变化规律，提供各种癌变干预阻断措施确切疗效评估的技术平台；同时筛选和鉴定系列生物标志物，制备疾病相关功能分类生物芯片，最终建立准确判断胃癌前期病变癌变转归和评价各种干预阻断方法可靠实用的监测体系。研究流程技术路线如图：

论文目录

• 英文缩写索引
• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究背景
• 研究部分
• §Ⅰ 胃癌前期病变监测关键技术（MTB）研究——定标活检钳的发明和成功研制
• 前言
• 一、定标活检医学要求的提出
• 二、定标活检钳的研制
• 三、定标液的研制
• 四、动物实验
• 五、临床实验
• 六、命名定标活检技术申报专利和相关产品开发
• 参考文献
• 附件1 浙江省卫生厅批文
• 附件2 浙江省医药卫生科学研究基金申请书
• 附件3 定标知情同意书
• 附件4 发明专利证书（01112558.6）
• 附件5 新型实用专利证书（01276725.5）
• 附件6 新型实用专利证书（01276535.X）
• §Ⅱ 热休克蛋白在胃癌前疾病和胃癌中的表达及意义探讨
• 前言
• 一、热休克蛋白在不同个体不同疾病状态下蛋白和mRNA表达水平的研究
• （一） 研究目的和内容
• （二） 研究材料和方法
• （三） 结果
• （四） 讨论
• （五） 结论
• 器材与试剂
• 参考文献
• 二、采用MTB技术对同一个体胃癌前疾病不同阶段热休克蛋白的蛋白和mRNA表达变化长期监测的打算和预试验
• §Ⅲ 建立胃癌前期病变癌变准确监测体系的思考和建议
• 一、建立胃癌前期病变癌变准确监测体系的必要性
• 二、建立胃癌前期病变癌变准确监测体系的可行性
• 三、建立胃癌前期病变癌变准确监测体系的基本框架
• 四、胃癌前期病变癌变准确监测体系基础上可解决的问题
• 五、最终目标
• 参考文献
• 总结
• 综述1:慢性萎缩性胃炎病理及病理生理的监测
• 综述2:染色内镜
• 在读期间发表的文章
• 致谢