论文摘要
细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种,目前认为程序性细胞死亡主要包括两种细胞死亡形式：细胞凋亡和自吞噬型细胞死亡。细胞凋亡和细胞增殖、细胞分化一样,在生物体的生长发育、器官形成、形体塑造及其内部稳态维持等生命过程中都起着关键性作用。细胞凋亡程序失调可导致肿瘤生成、自免疫失调、神经变性、定向造血干细胞缺乏和不孕不育等。目前,关于细胞凋亡机制的研究主要集中在线虫、果蝇、哺乳动物等模式生物,其中以线虫的凋亡机制最为简单,而哺乳动物的凋亡机制最复杂。家蚕属于完全变态昆虫,经过卵、幼虫、蛹和成虫四个发育阶段完成其生命周期。此外家蚕还具有易饲养,世代短,子代多,遗传背景清楚,经济价值高等优势,2002年国际无脊椎动物协会将家蚕确定为鳞翅目模式昆虫。上世纪60年代家蚕与果蝇的细胞凋亡研究并驾齐驱,然而自此家蚕的凋亡研究出现了停滞,直到上世纪末才开始回温,但主要集中在凋亡基因的克隆与验证,这与家蚕模式化趋势形成了巨大反差。同时,家蚕凋亡机制不可能完全被其他物种凋亡机制所代替,由此家蚕细胞凋亡研究的开展已迫在眉睫。本研究利用家蚕全基因组数据、ESTs数据及芯片数据,对家蚕凋亡相关基因进行了系统的生物信息学分析和表达模式研究。同时采用基因克隆测序对新鉴定的基因进行了证实,并在此基础上推测了家蚕中可能存在的细胞凋亡路径。此外,通过RT-PCR、原核表达、免疫荧光和异位表达等技术对家蚕凋亡相关基因BmDronc和BmBuffy的功能进行了探讨。本研究获得的主要研究结果如下：1.家蚕细胞凋亡相关基因的生物信息学分析及验证通过生物信息学分析方法,利用9×家蚕基因组数据,共分析鉴定了52个家蚕凋亡相关基因,包括5个Caspase家族成员,1个Bcl-2家族成员,2个TNFSF家族成员和4个BIR结构域家族成员。其中17个基因已经被NCBI收录,另外35个凋亡相关基因首次被本研究鉴定。40个基因有EST证据,其余基因的EST证据不完整或没有。对32个凋亡基因设计了特异性引物,以不同时期和不同处理的家蚕细胞cDNA为模板进行了RT-PCR扩增。其中,23个凋亡相关基因已经克隆并测序；5个凋亡相关基因被RT-PCR检测到但没有测序成功；4个凋亡相关基因RT-PCR没有检测到。RT-PCR结果表明,绝大部分凋亡相关基因在家蚕中是表达的,揭示出这些凋亡相关基因在家蚕中是存在的。不同物种凋亡基因的数目比较结果显示,昆虫之间的同源性更高些。但是仍还有很多凋亡基因在家蚕相关数据库中并没有找到其相应的同源物,包括几乎所有的Bcl-2和TNFSF家族成员caspase-6/7,和RHG家族的Hid, Grim及Sickle等。通过与哺乳动物细胞凋亡网络基因相比较,发现本研究分析验证的家蚕细胞凋亡相关因子已经基本覆盖了细胞凋亡路径中绝大部分的关键位点。由此推测其他几种模式生物细胞凋亡的两种途径,即外源性途径和内源性途径在家蚕细胞凋亡路径中也是存在的。2.家蚕凋亡相关基因BmDronc的克隆鉴定及功能研究本研究克隆了细胞凋亡路径中起重要作用的Caspase家族成员Caspase-9的家蚕同源物BmDronc,获得包括其完整ORF的cDNA序列。该基因位于No.10染色体上,有两种RNA剪切形式,分别命名为BmDroncL和BmDroncS。外显子数目分别为9个和5个,ORF长度分别为1248bp和552bp,编码415aa和183aa,预测分子量大小分别为47.76kDa和21.39kDa,等电点为7.65和9.35。与其他物种的相似性为40%-53%,一致性为23%-33%。BmDroncL和其他物种的Caspase一样具有三个经典的结构域,即CARD、大亚基和小亚基,而BmDroncS则缺少了大亚基。将不同物种Caspase-9同源物蛋白序列进行比对、构建系统进化发生树,结果发现从低等动物到高等动物Caspase-9是高度保守的。以家蚕变态发育期不同组织及整蚕为材料进行BmDronc基因RNA水平的表达变化检测,表明BmDronc在家蚕变态过程中具有重要作用。BmDronc在Sf-9细胞中异位表达结果表明：转染A4-BmDronc-DsRed的Sf-9细胞表现出细胞收缩和细胞核固缩等典型凋亡特征,暗示家蚕BmDronc可促进Sf-9细胞凋亡。3.家蚕凋亡相关基因BmBuffy的克隆鉴定及功能研究本研究通过5’和3’RACE PCR技术克隆了家蚕Bcl-2家族同源基因BmBuffy,得到了全长为1632bp的cDNA序列,预测其ORF长879bp,编码292个氨基酸,含有BH1、BH2和BH3结构域及一个跨膜区域。BmBuffy系统进化树分析结果显示：BmBuffy与昆虫中蜜蜂和果蝇的Buffy的亲缘关系最近,与哺乳动物类Bok基因聚为一类。BmBuffy与果蝇,人的相似性分别为49%和51%。BmBuffy位于nscaf3077、nscaf2981和nscaf2983上,分别位于No.4和No.7染色体上。遗传学多态性连锁分析结果表明：nscaf2983和nscaf3077应位于No.4染色体上,但不能断定nscaf2981位置。然而根据nscaf2981所在的染色体位置——-No.7染色体端部和nscaf2983与nscaf3077的定位实验结果,很大程度上可以推断出Bmbuffy基因应位于No.4染色体上。以家蚕变态发育期不同组织及整蚕为材料进行实时定量,检测BmBuffy基因RNA水平的表达变化。结果显示：BmBuffy在蚕体和不同组织中的表达变化并没有规律性变化,而且BmBuffy在变态的两个关键点变化也不一致,推测BmBuffy可能具有凋亡以外的生理功能。本研究通过体外重组技术得到了BmBuffyPpET21 a（BmBuffyP为无跨膜片段）重组子；然后进行原核表达、蛋白纯化、成年雄兔免疫,检测血清效价；最后采血、抗体纯化,抗体检测等一系列相关实验,制备得到BmBuffyP的多克隆抗体。通过对内质网和线粒体探针标记后的家蚕细胞进行BmBuffy免疫荧光定位实验,结果表明BmBuffy不定位于内质网,而定位于线粒体。这说明了BmBuffy有可能参与线粒体凋亡路径的调控。本研究采用了人原胚肾细胞HEK293表达系统,对BmBuffy和BmBuffyP进行了异位表达。结果表明在分别转染BmBuffypEGFP、BmBuffyPpEGFP和pEGFP-N1的HEK293细胞中,细胞核和细胞形态没有太大变化,说明凋亡并没有发生。据此推测如果BmBuffy在凋亡中起作用,那么其功能可能是在BmDronc的上游受到调控。
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相关论文文献
- [1].家蚕Bcl-2家族基因BmBuffy的克隆及表达分析[J]. 昆虫学报 2015(07)