H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠间水平传播能力研究及其反向遗传系统构建

论文摘要

H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）在家禽中广泛流行并偶发感染人的事件。为探讨H9N2亚型AIV在哺乳动物间的水平传播能力，本研究对当前我国北方地区流行的H9N2亚型AIV的进化特点、在哺乳动物体内复制能力、哺乳动物间的传播能力及对病毒在不断适应哺乳动物宿主的过程中是否会获得水平传播能力开展初步研究和探讨。HA基因、NA基因和M基因的进化分析表明，5株H9N2亚型AIV均属于我国流行谱系CK/Beijing系，说明我国北方地区流行的H9N2亚型AIV基因谱系相对单一。NS基因的进化分析表明，3株病毒属于G1谱系，另外2株病毒分别属于CK/Beijing谱系和Korean谱系，并且该谱系还包含了H6N1亚型AIV和H5N1亚型AIV。HA的分子特征分析表明，5株病毒不具备多碱性裂解位点，具有低致病性禽流感病毒的特征。应用鸡红细胞受体检测病毒HA的受体结合能力发现，3株病毒具有识别α2,6-糖苷键唾液酸受体（SAα2,6Gal）（人样受体）能力，另2株病毒具有识别α2,3-糖苷键唾液酸受体（SAα2,3Gal）（禽样受体）的能力。5株病毒都不需要适应就可以在小鼠体内肺部很好的复制，接种72h后剖检，观察各组小鼠的肺脏没有明显的肉眼可见的病理变化，肺脏组织病毒滴度在4.35.2LogEID50/mL。其中3株病毒感染的小鼠脑内检测到流感病毒，病毒滴度范围在1.52.25LogEID50/mL。14d的观察期内，各组小鼠没有表现出明显的临床症状，精神状态良好，采食与饮水都正常，体重增长正常。5株病毒都能在豚鼠的上呼吸道很好的复制，并且在鼻甲骨处复制能力最强，平均病毒滴度在2.014.5LogEID50/mL。所有实验豚鼠的脾脏、肝脏、肾脏、脑内均未检出病毒；14d观察期内各组豚鼠均未表现临床症状，采食与饮水正常。剖检后各种组织和器官没有明显的病理变化。传播能力评估实验表明，5株病毒接种的豚鼠鼻洗液中能够检测到病毒，表明病毒能够通过豚鼠的呼吸道向外排毒，最长排毒期一般不超过8d。但5株病毒都不能在豚鼠间发生接触传播。A/Chicken/Jinan/Li-2/2010（H9N2）株病毒在豚鼠体内传代的结果表明，当病毒株传到第9代时，获得了在豚鼠间发生同群接触传播的能力。初步序列分析表明，P9传代病毒和原病毒序列分析比较发现，血凝素蛋白（HA）有2个氨基酸不同，PB1蛋白有1个氨基酸不同，但是非结构蛋白（NS）、基质蛋白（M）、PA蛋白、NP蛋白和NA蛋白没有发生变化；PB2蛋白在测序当中。受体结合特性表明，P9传代病毒仍识别SAα2,6Gal（人样受体）。构建了A/Chicken/Jinan/Li-2/2010（H9N2）株病毒的反向遗传平台，为进一步研究影响流感病毒传播的分子机制搭建平台。上述研究结果表明具有SAα2,6Gal（人样受体）结合能力的H9N2亚型AIV可以在小鼠和豚鼠哺乳动物模型体内有效复制，但无法在豚鼠间传播，但病毒在以豚鼠作为模型的哺乳动物宿主体内适应后可获得水平传播的能力，这一研究结果提示我们H9N2亚型AIV具有通过适应获得在哺乳动物间水平传播的能力，其公共卫生意义应引起关注。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 禽流感气源性传播研究的意义
• 1.2 流感病毒传播的研究进展
• 1.2.1 流感病毒传播的动力学基础
• 1.2.2 流感病毒传播能力评估
• 1.2.3 人流感病毒和禽流感病毒的传播能力
• 1.2.4 流感病毒的传播模式
• 1.2.5 流感病毒传播的哺乳动物模型
• 1.2.6 2009H1N1 流感病毒的传播能力
• 1.3 影响流感病毒传播的因素
• 1.3.1 环境因素影响
• 1.3.2 受体和表面糖蛋白对流感病毒传播的影响
• 1.3.3 流感病毒的关键氨基酸对流感病毒传播的影响
• 1.4 药物和非药物对流感病毒传播的影响
• 1.4.1 注射疫苗
• 1.4.2 抗病毒药物
• 1.4.3 干扰素对流感病临床症状的治疗
• 1.5 本研究的意义
• 第二章 H9N2 亚型 AIV 部分基因序列分析及受体结合特性初步检测
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 病毒株
• 2.1.2 菌株与载体
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 引物
• 2.1.6 病毒核酸的提取 RT-PCR 及测序
• 2.1.7 系统发育进化树的构建及遗传演化分析
• 2.1.8 红细胞受体结合特性检测方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 5株 H9N2 亚型 AIV 血凝素蛋白（HA）分子特征分析
• 2.2.2 5株 H9N2 亚型 AIV 部分基因的进化树分析
• 2.2.3 重唾液酸化红细胞法检测病毒受体结合特性
• 2.3 讨论
• 第三章 H9N2 亚型 AIV 复制能力与传播能力评估
• 3.1 材料方法
• 3.1.1 病毒株
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 评价 H9N2 亚型 AIV 在小鼠体内复制情况
• 3.1.4 评价 H9N2 亚型 AIV 在豚鼠体内复制情况
• 3.1.5 H9N2 亚型禽流感病毒在豚鼠间传播能力的评估
• 3.2 结果
• 3.2.1 H9N2 亚型 AIV 在小鼠体内复制结果
• 3.2.2 H9N2 亚型禽流感病毒在豚鼠体内复制结果
• 3.2.3 H9N2 亚型禽流感病毒在豚鼠间传播能力的评估结果
• 3.3 讨论
• 第四章 H9N2 亚型 AIV 在豚鼠体内连续传代后传播能力评估
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 病毒株
• 4.1.2 实验动物
• 4.1.3 H9N2 亚型 AIV 在豚鼠体内连续传代方法
• 4.1.4 豚鼠鼻洗液中病毒的增殖方法
• 4.1.5 传代病毒在豚鼠间传播能力的评估
• 4.1.6 P9 传代毒红细胞受体结合特性检测
• 4.1.7 P9 传代病毒全基因测序
• 4.2 结果
• 4.2.1 H9N2 亚型 AIV 在豚鼠体内连续传代后鼻洗液中病毒的滴定情况
• 4.2.2 P9 传代病毒在豚鼠间传播能力评估的结果
• 4.2.3 P9 传代病毒的受体结合特性
• 4.2.4 P9 传代病毒与原代病毒部分基因片段氨基酸的比较
• 4.3 讨论
• 第五章 传代病毒株反向遗传系统的构建
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 病毒株
• 5.1.2 实验动物和细胞
• 5.1.3 实验用质粒载体和主要试剂
• 5.1.4 主要仪器
• 5.1.5 实验所用引物
• 5.1.6 H9N2 亚型禽流感病毒的拯救
• 5.1.7 评价拯救毒株对小鼠的致病力
• 5.2 结果
• 5.2.1 拯救病毒株的质粒和基因片段的 PCR 鉴定
• 5.2.2 评价拯救病毒株对小鼠的致病力
• 5.3 讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历