益气养阴活血法改善糖尿病合并脑缺血大鼠记忆能力及神经再生研究

论文摘要

1.目的前期研究结果显示,气阴两虚、瘀血阻络是糖尿病合并脑缺血的最常见的基本证候,首先建立气阴两虚、瘀血阻络型糖尿病合并脑缺血大鼠模型,观察高血糖对大鼠空间学习记忆能力的影响,以及对海马DG区神经细胞的增殖、分化、存活及BDNF通路的影响,然后观察益气养阴活血中药体内和体外的干预作用,并运用工具药证实BDNF通路在其中的作用。2.方法2.1采用持续力竭性游泳、甲状腺素片混悬液灌胃、腹腔注射STZ以及线栓法制作糖尿病合并脑缺血气阴两虚、瘀血阻络证大鼠模型,从大鼠的血糖、神经功能、TTC和HE染色结果、一般状态、舌象以及最终的成功率等方面来探讨糖尿病合并脑缺血（气阴两虚、瘀血阻络）病证结合模型的可行性。2.2将30只大鼠分为假手术组、脑缺血组以及糖尿病合并脑缺血组,每组10只,用Brdu掺入法结合免疫组化观察糖尿病对脑缺血后大鼠海马齿状回（DG）神经细胞的新生、分化和存活的情况,免疫组化法观察BDNF表达情况,并用Morris水迷宫实验评估糖尿病对脑缺血大鼠空间学习和记忆能力的影响。2.3将大鼠分为假手术组、糖尿病合并脑缺血（气阴两虚、瘀血阻络证）模型对照组、益气养阴活血组、益气养阴活血+K252a（BDNF的Trk受体抑制剂）组、益气活血组,每组10只,选用了具有益气养阴活血作用的人参、川芎、玉竹、黄精组合,运用Brdu掺入法、免疫组化和Morris水迷宫实验来观察益气养阴活血法对糖尿病合并脑缺血大鼠空间学习记忆的作用和神经再生机制。2.4神经干细胞培养分为4组：正常对照组、缺血再灌注模型组、缺血再灌注后高糖模型组、缺血再灌注后高糖加益气养阴活血药物血清组。Brdu掺入法观察神经干细胞的增殖,甲基噻唑基四唑比色实验检测细胞活性。3.结果3.1动物模型研究结果表明,糖尿病合并脑缺血（气阴两虚、瘀血阻络）病证结合模型的最终成功率为63%,大鼠在表征、舌象、神经功能缺损、脑组织形态学以及大鼠最终的存活率等几方面指标的综合评价符合该模型的评价体系。3.2糖尿病对脑缺血大鼠空间记忆、海马神经再生及BDNF表达的影响本研究结果显示,与假手术组和模型组比较,长期高血糖能加重脑缺血大鼠的Morris水迷宫空间学习记忆能力损伤（P<0.05）,但糖尿病对于脑缺血后大鼠神经细胞的增殖没有显著的影响（P>0.05）,而对于脑缺血后大鼠新增殖细胞的存活及向神经元分化具有明显的抑制作用（P<0.001）。我们的研究还发现,糖尿病合并脑缺血大鼠海马齿状回BDNF表达较单纯脑缺血明显降低（P<0.001）。由于BDNF与神经再生相关,推测糖尿病可能通过抑制BDNF而影响神经再生。3.3益气养阴活血药物在糖尿病合并脑缺血大鼠模型中,通过BDNF调节海马的神经再生,并促进空间学习记忆的恢复研究结果显示,糖尿病合并脑缺血可使海马齿状回颗粒下层新生细胞增多,但益气养阴活血药物不能促进糖尿病合并脑缺血大鼠新生细胞的进一步增加（P>0.05,）。与糖尿病合并脑缺血组比较,益气养阴活血药物和益气活血药物均可以明显提高新生细胞的存活率、促进新生细胞向神经元分化（P<0.05）,同时增加海马齿状回BDNF的表达（P<0.01）,并促进糖尿病合并脑缺血大鼠的空间记忆能力的恢复（P<0.05-0.01）,其中益气养阴活血药物效果优于益气活血药物（P<0.05）。侧脑室注射BDNF抑制剂K252a可以抑制益气养阴活血药物促进新生细胞存活和向神经元分化的作用（P<0.001）,并抑制糖尿病合并脑缺血大鼠的空间记忆能力的恢复（P<0.001）。3.4益气养阴活血药物血清对高糖合并缺血再灌注培养模型中大鼠神经干细胞增殖和活力的影响结果显示,与正常组比较,脑缺血再灌注后神经干细胞增值显著增加（P<0.01）,细胞活力下降（P<0.01）；高糖可抑制神经干细胞的增殖（P<0.05-0.01）,降低细胞活力（P<0.05-0.01）；益气养阴活血药物血清可促进神经干细胞的增殖（P<0.01）,提高其活力（P<0.01）。我们的体外培养结果证实了益气养阴活血药物能促进脑缺血再灌注合并高糖培养条件下神经干细胞的增殖,提高细胞活力。4.结论4.1腹腔注射链脲佐菌素、持续力竭性游泳、甲状腺素片混悬液灌胃以及线栓法制作糖尿病合并脑缺血（气阴两虚、瘀血阻络）大鼠模型,从表征、舌象、神经功能缺损、脑组织形态学以及存活率等方面综合评价大鼠病证结合模型是成功的；4.2糖尿病可能通过降低BDNF的表达,从而抑制再生神经存活和向神经元分化,进而加重脑缺血后的空间学习记忆障碍；4.3益气养阴活血药物可能通过BDNF介导的神经再生和向神经元定向分化而改善空间记忆功能；4.4益气养元活血药物可促进脑缺血再灌注后高糖培养大鼠神经干细胞的增殖,提高细胞活力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 第一部分 文献综述
• 文献综述一 糖尿病及高血糖对缺血性脑卒中发生和预后的影响
• 参考文献
• 文献综述二 脑缺血后神经再生研究进展
• 参考文献
• 文献综述三 糖尿病合并缺血性脑卒中的中医药治疗进展
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 前言
• 第一章 糖尿病合并脑缺血气阴两虚、瘀血阻络证型大鼠模型的建立及评价
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 参考文献
• 第二章 高血糖对脑缺血大鼠空间学习记忆、海马神经再生和BDNF表达的影响
• 1. 实验材料和方法
• 2. 实验结果
• 3. 讨论
• 4. 参考文献
• 第三章 益气养阴活血药物在糖尿病合并脑缺血大鼠模型中,通过BDNF调节海马的神经再生,并促进空间学习记忆的恢复
• 1. 实验材料和方法
• 2. 实验结果
• 3. 讨论
• 4. 参考文献
• 第四章 益气养阴活血药物血清对高糖合并缺血再灌注培养模型中大鼠神经干细胞增殖和活力的影响
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 参考文献
• 结语
• 致谢
• 个人简介