西洋参悬浮细胞大量培养技术研究

论文摘要

西洋参（Panax quinquefolium）是五加科（Aralaccae）人参属多年生草本名贵药材,其性较温和,具有滋补、强心、镇定、抗癌和抗衰老等多种医疗功效。现代化学及药理学研究表明:西洋参的主要有效成份是人参皂甙（Saponin）,目前还不能人工合成。无论野生还是栽培的西洋参由于其自身的生理特性,一般需四至六年才能收获入药,产量远远不能满足市场的需要。因此,通过细胞培养方法大量生产人参皂甙,以满足人们的需要,具有十分重要的意义和广阔的市场前景。以四年生西洋参根为实验材料,在MS基本培养基中添加2,4-D、KT等植物激素,通过对参根外植体的诱导和培养,筛选出来质地疏松、生长快速的愈伤组织无性系。然后,通过对MS基本培养基中添加的2,4-D、KT、NAA、IBA等不同植物激素的浓度配比与组合的筛选,建立了西洋参愈伤组织无性系培养的生长培养基配方（MS+1.0mg/L2.4-D+0.1mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA+700mg/L LH+3%蔗糖）。将该愈伤组织接种到液体培养基中进行振荡培养,经多次继代,筛选获得了分散程度好的西洋参悬浮细胞系,并对其进行了动力学分析,表明该细胞系具有高产、性能稳定的特点,可用于大规模的工业化生产人参皂甙。通过在西洋参细胞悬浮培养过程中添加、改变各种理化因子,研究其理化因子与西洋参悬浮细胞生长量和皂甙产量的关系。发现将MS培养基中的肌醇、烟酸、维生素B1、维生素B6、甘氨酸的浓度增加一倍,可以使西洋参细胞培养物的生长量提高100%。西洋参悬浮细胞培养至高峰期（20天左右）,在培养液中添加终浓度为18-40g/L的D-半乳糖,可使西洋参悬浮细胞培养物中皂甙产量提高2倍以上,达到677.25mg/L。并且,D-半乳糖也具有促进细胞生长的作用。建立并优化了西洋参悬浮细胞培养工艺体系:培养温度（24±1）℃,培养液pH值6.0,生长周期是25-30天。取处于对数生长期的西洋参悬浮细胞接种到悬浮细胞培养液中,当细胞仍处于生长延迟时（接种后4天左右）,无菌条件下收集悬浮细胞,重新接种于新鲜发酵培养液中继代培养,20天后补料,5天后收获。采用该工艺西洋参悬浮细胞生长量可提高2.6倍以上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 西洋参愈伤组织的诱导和培养
• 1.1.1 外植体
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 植物激素的种类和浓度
• 1.1.4 培养条件
• 1.1.5 皂甙含量
• 1.2 西洋参细胞悬浮培养
• 1.2.1 西洋参悬浮培养细胞无性系的诱导与筛选
• 1.2.2 西洋参细胞悬浮培养生长周期
• 1.2.3 影响西洋参细胞悬浮培养生长和人参皂甙生产的培养条件
• 1.3 西洋参细胞发酵培养
• 1.4 展望
• 2 西洋参愈伤组织的诱导、培养及悬浮细胞系的建立
• 2.1 材料
• 2.2 试剂和设备
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 设备
• 2.2.3 培养基
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞生长量和生长速度的测定
• 2.3.2 人参皂甙的提取及测定
• 2.3.3 糖利用率的测定
• 2.3.4 西洋参愈伤组织的诱导
• 2.3.5 西洋参愈伤组织无性系和继代培养基的筛选
• 2.3.6 西洋参悬浮培养高产细胞株
• 2.3.7 西洋参细胞保存方法
• 3 西洋参细胞培养动力学分析
• 3.1 西洋参愈伤组织生长曲线
• 3.2 西洋参悬浮细胞生长曲线
• 3.3 愈伤组织继代培养基最佳pH筛选
• 3.4 西洋参细胞悬浮培养培养液最佳pH值的筛选
• 3.5 西洋参细胞悬浮培养不同装液量与细胞生长量的关系
• 3.6 西洋参细胞悬浮培养不同温度与细胞生长量的关系
• 3.7 西洋参悬浮细胞培养过程中蔗糖浓度的变化
• 4 理化因子对西洋参悬浮细胞培养及皂甙合成的影响
• 4.1 材料
• 4.2 肌醇等物质对悬浮细胞生长的影响
• 4.3 D-半乳糖等诱导子对西洋参悬浮细胞的影响
• 5 西洋参悬浮细胞培养工艺研究
• 5.1 延迟期种子细胞预处理对悬浮细胞生长的影响
• 5.2 补料对悬浮细胞生长的影响
• 5.3 优化西洋参悬浮细胞培养发酵工艺
• 6 结果与讨论
• 6.1 西洋参愈伤组织诱导的影响因素
• 6.2 外源激素对西洋参愈伤组织生长的影响
• 6.3 西洋参悬浮细胞系的建立
• 6.4 西洋参愈伤组织和悬浮细胞的保存
• 6.5 pH对细胞生长及皂甙合成的影响
• 6.5.1 pH对愈伤组织生长和皂甙含量的影响
• 6.5.2 pH对悬浮细胞生长的影响
• 6.5.3 关于培养基pH值的讨论
• 6.6 温度对西洋参悬浮培养细胞生长的影响
• 6.7 摇瓶培养中装液量与细胞生长的关系
• 6.8 西洋参愈伤组织生长曲线
• 6.9 西洋参悬浮培养细胞生长曲线
• 6.10 西洋参悬浮培养细胞的生长状态
• 6.11 诱导子等对西洋参悬浮细胞的影响
• 6.11.1 肌醇等物质对西洋参悬浮细胞生长的影响
• 6.11.2 稀土镧、钟对西洋参悬浮细胞生长的影响
• 6.11.3 甘露醇、D-半乳糖等诱导子对西洋参悬浮细胞生长的影响
• 6.12 西洋参悬浮细胞培养工艺研究
• 6.12.1 延迟期种子细胞预处理对悬浮细胞生长的影响
• 6.12.2 补料对西洋参悬浮细胞生长的影响
• 6.13 优化发酵工艺条件下细胞生长量及其皂甙产量
• 结论
• 参考文献
• 后记（含致谢）
• 攻读学位期间取得的科研成果清单Ⅰ
• 攻读学位期间取得的科研成果清单Ⅱ