林可霉素降解菌的分离、鉴定及降解特性研究

论文摘要

林可霉素是一种碱性广谱抗生素,工业上经林肯链霉菌发酵后分离提取而成。对发酵液进行固液分离时形成的副产品药饼部分就是废渣,富含粗蛋白、氮磷钾无机盐、各种必需氨基酸、维生素和微量元素,营养丰富。然而由于残留有林可霉素药效成分,容易引起耐药性并存在各种安全隐患,废渣已被国家环保部门作为难以治理和综合利用的危险废弃物。废渣既不可以作为饲料,也不可以用作肥料,造成了资源的浪费。如何将林可霉素菌渣变废为宝、减少对周围环境的污染,成为摆在抗生素生产企业面前亟待解决的一个难题。微生物降解是环境修复及抗生素在环境中降解的重要途径之一。但纵观国内外研究现状,尚未发现有关生物降解林可霉素的报道。本文分离筛选出几株具有林可霉素降解能力的微生物菌种,对其进行分类归属,为研究降解林可霉素的相关功能基因,构建高效降解林可霉素的基因工程菌奠定基础,通过研究优化菌株的最佳降解工艺条件,为降解菌应用于微生物法处理废渣中残留的林可霉素提供参考。主要研究内容及结论如下：(1)采用常规富集驯化培养法、浓度梯度平板法、原位培养法和双琼脂层顶封法等多种方法,从南阳普康药业有限公司废渣堆放处的土壤及活性污泥等环境中分离出52株具有林可霉素降解能力的菌株。(2)采用紫外分光光度法、可见分光光度法及高效液相色谱法检测基础培养基中林可霉素含量,并通过线性关系、精密度、重现性、回收率及稳定性考察证实这三种方法的合理性和可行性。最终确定在初期林可霉素降解菌的分离筛选过程中,用较高浓度的林可霉素培养大批样品,选择可见分光光度法进行检测。在筛选出具有一定降解能力的菌株,对其降解特性进行研究时,采用紫外分光光度法。在确定最佳降解条件后对工艺进行验证的过程中,采用最为准确的高效液相色谱法进行检测。(3)建立琼脂平板直接筛选和硅胶平板直接筛选林可霉素降解菌的两种新方法,并对其进行方法学考察及工艺优化。采用这两种方法及常规分离方法最终选出三株降解率在50%以上的菌株,其编号分别为LD9#、LD19#和LD25#。(4)通过形态观察、Vitek微生物自动鉴定系统检测、常规生理生化鉴定及16SrDNA全序列分析获知LD 9#、LD 19#和LD 25#菌株分别为苍白杆菌(Ochrobactrumsp.)、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp)和寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)。(5)通过单因素、两因素及正交试验考察pH值、接种量、培养温度、转速、外加碳源种类、碳源加量(g/L)及林可霉素浓度(g/L)等因素对降解菌降解率的影响,最终确定LD 9#、LD 19#和LD 25#菌株的最佳降解条件分别为：以葡萄糖、淀粉、淀粉为外加碳源,其加量分别为0.25 g/L、0.1 g/L和0.25 g/L；培养基初始pH分别为9、7、7,培养温度均为37℃,转速均为80 rpm/min,林可霉素加量分别为1.5 g/L、1.5 g/L和1.0 g/L,接种量均为10%。在确定的最佳工艺条件下进行验证实验,结果表明LD 9#、LD 19#和LD 25#菌株的降解率均达到90%以上

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 抗生素的应用及其环境行为
• 1.1.1 抗生素的生产及应用
• 1.1.2 环境中的抗生素残留
• 1.1.3 微生物抗生素耐受性的产生及耐药机制
• 1.1.4 抗生素降解的研究现状
• 1.1.5 废渣中抗生素残留的研究现状
• 1.2 抗生素降解菌的分离筛选及鉴定
• 1.2.1 降解菌的分离筛选方法
• 1.2.2 分离的抗生素降解菌
• 1.2.3 微生物菌种的分类鉴定
• 1.3 影响微生物生长及降解特性的因素
• 1.4 林可霉素概述
• 1.4.1 林可霉素的理化性质
• 1.4.2 林可霉素的检测方法
• 1.4.3 林可霉素生产废渣的特点及其综合利用
• 1.5 本研究的目的与意义
• 第二章 林可霉素降解菌的分离筛选
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要仪器与试剂
• 2.2.2 培养基成分
• 2.2.3 样品采集及处理
• 2.2.4 菌种的分离筛选
• 2.2.5 降解实验
• 2.3 结果及分析
• 2.3.1 菌种的分离筛选
• 2.3.2 降解实验
• 2.4 讨论
• 第三章 基础培养基中林可霉素含量测定方法的确立
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要仪器与试剂
• 3.2.2 实验所用培养基
• 3.2.3 样品处理
• 3.2.4 计算公式
• 3.3 结果及分析
• 3.3.1 紫外光区及可见光区最大吸收波长的选择
• 3.3.2 培养基中林可霉素含量测定的方法学考察
• 3.4 讨论
• 第四章 采用琼脂平板及硅胶平板直接筛选林可霉素降解菌
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要仪器及试剂
• 4.2.2 平板制作及试剂配制
• 4.2.3 可见分光光度法测定硅胶平板中林可霉素的含量
• 4.2.4 紫外分光光度法测定琼脂平板中林可霉素的含量
• 4.2.5 林可霉素降解菌的分离筛选
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 可见分光光度法测定硅胶平板中林可霉素的含量
• 4.3.2 紫外分光光度法测定琼脂平板中林可霉素的含量
• 4.3.3 林可霉素降解菌的分离筛选
• 4.4 讨论
• 第五章 林可霉素降解菌的鉴定
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要仪器与试剂
• 5.2.2 形态学观察
• 5.2.4 生理生化鉴定
• 5.2.5 VITEK全自动微生物分析仪检测方法
• 5.2.6 16S rDNA分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 形态学观察
• 5.3.2 生理生化鉴定
• 5.3.3 16S rDNA序列分析
• 5.4 讨论
• 第六章 林可霉素降解菌的降解特性研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 主要仪器与试剂
• 6.2.2 林可霉素在不同pH及时间下的自然降解两因素试验
• 6.2.3 培养基初始pH对菌株降解率的影响
• 6.2.4 接种量对菌株降解率的影响
• 6.2.5 培养温度对菌株降解率的影响
• 6.2.6 转速对菌株降解率的影响
• 6.2.7 外加碳源对菌株降解率的影响
• 6.2.8 降解条件的正交试验优化
• 6.3 结果及分析
• 6.3.1 林可霉素在不同pH及时间下的自然降解两因素试验
• 6.3.2 培养基初始pH对菌株降解率的影响
• 6.3.3 接种量对菌株降解率的影响
• 6.3.4 培养温度对菌株降解率的影响
• 6.3.5 转速对菌株降解率的影响
• 6.3.6 外加碳源对菌株降解率的影响
• 6.3.7 正交试验结果及分析
• 6.4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录