基于适体的癌细胞检测及碳纳米管复合材料生物相容性研究

论文摘要

准确、灵敏地诊断白血病对于临床医生选择合适的治疗方法至关重要。目前白血病诊断的常规技术往往耗时、成本高、检测仪器昂贵,所以,开发一些检测成本低,使用仪器简单,并能提供灵敏、准确的诊断结果的方法是即时诊断领域的发展目标。适体是一种被视为化学合成抗体的单链DNA/RNA构成的分子探针,在生物医学领域具有广阔的应用潜力。本论文在基于适体的肿瘤细胞检测方面开展了一些研究工作。另外,构建纳米复合材料用于发展骨组织工程意义重大。本论文的主要研究工作如下:1.将对人急性白血病细胞（CCRF-CEM）具有特异性识别能力的巯基修饰适体（sgc8c）自组装到金电极表面,开发了一种简单、方便、低成本、无标记的早期检测白血病细胞的电化学传感器。用循环伏安和电化学阻抗表征了修饰电极,并通过计时库仑分析得到了电极表面的适体密度。所制备的适体传感器经CCRF-CEM细胞孵育后,电极界面上的电子转移电阻（Ret）显著增大;且传感器对CCRF-CEM细胞具有良好的选择性。Ret值和细胞浓度对数值呈线性关系,检测线性范围为1×104-1×107 cells/mL,检测限为6×103 cells/mL。2.利用无标记金纳米颗粒（AuNPs）做指示剂,开发了一种可视比色检测肿瘤细胞的方法。该分析主要是基于单链DNA能够展开并暴露出碱基部分,吸附到AuNPs表面,从而使得AuNPs在高盐浓度下保持稳定。当将CCRF-CEM细胞悬浮液和单链寡核苷酸适体sgc8c孵育后,适体可选择性地结合到目标细胞表面,使得离心上清液中DNA的浓度降低,导致AuNPs在高盐浓度下失去稳定并发生团聚,而非目标细胞RAJI和随机序列DNA不会引起AuNPs溶液颜色的变化。该方法在肉眼比色分析和光谱分析方面都具有很好的灵敏度。3.通过溶剂挥发法,将碳纳米管（CNTs）掺杂到壳聚糖-明胶（chitosan–gelatin, CG）复合材料中,显著增强了CG复合材料的机械性能,将扩大其在骨组织工程中的应用前景。用扫描电镜、接触角测试和拉伸测试表征了CG/CNTs材料的表面形貌、亲水性和机械性能。CNTs均匀地分散在CG膜的基质中;与CG膜相比,仅添加0.4% CNTs,纳米复合材料的杨氏模量就增强了180%。利用人成骨细胞MG-63研究了复合材料的生物相容性,显微镜观察、吖啶橙染色和MTT研究结果表明,CG/0.4% CNTs不会影响细胞的贴壁、铺展和增殖。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 适体
• 1.1.1 适体的特点
• 1.1.2 复合靶分子SELEX 技术
• 1.1.3 适体在肿瘤诊断中的应用
• 1.2 电化学细胞传感
• 1.2.1 细胞的循环伏安行为
• 1.2.2 细胞的电化学阻抗行为
• 1.3 纳米金比色分析
• 1.3.1 AuNPs 的表面等离子共振
• 1.3.2 AuNPs 胶体的稳定性
• 1.3.3 粒子间交联团聚作用
• 1.3.4 粒子间非交联团聚作用
• 1.4 骨组织工程
• 1.4.1 生物活性陶瓷材料
• 1.4.2 生物降解高分子材料
• 1.4.3 生物复合材料
• 1.5 本文构思
• 第2章 基于适体的肿瘤细胞电化学传感器
• 2.1 前言
• 2.2 实验操作
• 2.2.1 化学药品
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 适体修饰电极的制备和表征
• 2.2.4 细胞的培养和检测
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 适体修饰电极的EIS 表征
• 2.3.2 电极表面适体的定量
• 2.3.3 EIS 表征
• 2.3.4 荧光显微镜表征
• 2.3.5 循环伏安表征
• 2.3.6 CCRF-CEM 细胞的定量检测
• 2.4 结论
• 第3章 基于适体和无标记金纳米颗粒的癌细胞比色检测
• 3.1 前言
• 3.2 实验操作
• 3.2.1 实验仪器和试剂
• 3.2.2 纳米金的制备
• 3.2.3 细胞的培养
• 3.2.4 DNA 对AuNPs 保护条件的优化
• 3.2.5 肿瘤细胞的检测
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 DNA 与AuNPs 孵育时间的优化
• 3.3.2 DNA 浓度的优化
• 3.3.3 适体的选择性表征
• 3.3.4 CCRF-CEM 细胞的检测
• 3.4 结论
• 第4章 壳聚糖-明胶/碳纳米管复合膜的机械性能和生物相容性研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 试剂和材料
• 4.2.2 多壁碳纳米管的酸化
• 4.2.3 复合膜的制备
• 4.2.4 复合膜的表征
• 4.2.5 细胞培养
• 4.2.6 复合膜的生物相容性表征
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 酸化碳纳米管表面结构性质的表征
• 4.3.2 CG/CNTs 复合材料的形貌和亲水性表征
• 4.3.3 CG/CNTs 复合材料的机械性能表征
• 4.3.4 复合膜的生物相容性
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢