论文摘要
病理性血管生成是肿瘤生长和转移的关键步骤之一,因而阻断或抑制新血管生成是抗肿瘤的有效策略。近年来以抗血管生成为靶点已成为肿瘤治疗的研究热点,血管生成抑制剂类新药不断涌现,给肿瘤治疗带来了新的希望。虽然有些血管生成抑制剂已应用于临床,但是大部分化学类药物都由于毒性原因而受到限制。目前毒性已经成为阻碍化学类抗血管生成药物开发与临床应用的瓶颈,深入了解那些被淘汰化合物的毒性及毒性作用机制对于提高研发成功率具有重要意义。Z24是一种合成的化学类血管生成抑制剂,其药理作用靶点为碱性成纤维细胞生长因子和Bcl-2蛋白,体内外实验研究表明,Z24对多种肿瘤的生长具有明显的抑制作用,但临床前安全性研究发现一定剂量下Z24对啮齿类动物具有肝毒性,遵循前人研究血管生成抑制剂的经验,我们认为有必要研究清楚其可能存在的毒性作用和作用机制,这对于能够把Z24成功开发成为新的抗肿瘤药物具有重要的指导作用。因此,本课题对Z24的毒性作用机制进行了研究,首先建立了Z24经口染毒致大鼠肝损伤的动物模型,然后采用蛋白质组学技术对Z24引起的大鼠肝脏和血浆蛋白质表达谱的改变进行了分析,通过对差异表达蛋白进行功能分析,在蛋白质水平上推测Z24的肝毒性作用机制,并进行相应的功能验证研究,主要研究方法及结果如下:Z24经口染毒致大鼠肝损伤模型的建立:雌性Wistar大鼠,连续5d灌胃给予0、50、100、200mg/kg的Z24后,检测血浆肝功系列生化指标及肝脏组织病理学的变化。结果显示,100、200mg/kg组大鼠血浆AST、ALP、TBI、DBI、TG和Tch等水平明显升高,BUN含量明显下降,病理切片光镜下见3个Z24给药组均存在程度不等的肝细胞空泡变性和纤维组织增生,电镜下200mg/kg组可见细胞核皱缩、线粒体呈透明状、线粒体嵴断裂等超微结构改变。结果表明50mg/kg Z24可致大鼠肝脏轻微损伤, 100和200mg/kg剂量下具有明显肝毒性。Z24肝毒性的主要病理学特征是肝细胞脂肪变性和纤维组织增生。Z24染毒大鼠的肝脏差异表达蛋白分析:采用2-DE-MALDI-TOF-TOF-MS的方法对不同剂量Z24染毒大鼠与未染毒大鼠的肝脏全蛋白表达谱进行了比较研究,共鉴定出22种差异表达蛋白,包括二氢硫辛酰胺脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶α链、烯酰辅酶A水解酶、电子传递黄素蛋白脱氢酶、电子传递黄素蛋白α多肽、ATP合酶D链、甘油-3-磷酸脱氢酶1、鸟氨酸转氨酶前体、延胡索酰乙酰乙酸酶、甘氨酸N-甲基转移酶、支链酮酸脱氢酶E1α多肽、醛脱氢酶7A1及1B1、3α-羟化类固醇脱氢酶（3α-HSD）、谷胱甘肽S-转移酶α5（GST-α5）、谷胱甘肽S-转移酶P（GST-P）、硒结合蛋白2和PDZ/LIM结构域蛋白1等。这些蛋白中除了GST-α5、GST-P和PDZ/LIM结构域蛋白1表达上调之外,其余蛋白均表达下调。Z24染毒大鼠的血浆差异表达蛋白分析:采用2-DE-MALDI-TOF-TOF-MS的方法对不同剂量Z24染毒大鼠与未染毒大鼠的血浆蛋白表达谱进行了比较研究,共鉴定出11种差异表达蛋白,包括胎球蛋白B、精氨酸代琥珀酸合成酶、结合珠蛋白、丛生蛋白前体、载脂蛋白E前体、血清白蛋白前体等。其中胎球蛋白B和血清白蛋白前体表达下调,其它的蛋白均表现为表达上调。差异表达蛋白的功能分析及部分蛋白的表达验证:主要在SWISS-PROT数据库中对所鉴定的差异表达蛋白的功能及亚细胞定位进行了查询,利用Gene Ontology对差异蛋白的功能进行了分类,并采用Western blot方法对3α-HSD、GST-P和胎球蛋白B的表达情况进行了验证。发现在肝脏差异蛋白中,大部分（12/22）分布于线粒体;近1/3蛋白参与糖、脂肪和能量代谢途径,如二氢硫辛酰胺脱氢酶、烯酰辅酶A水解酶、电子传递黄素蛋白脱氢酶、ATP合酶D链等。在血浆差异表达蛋白中,胎球蛋白B和精氨酸代琥珀酸合成酶是肝毒性的潜在生物标志物,丛生蛋白与细胞凋亡密切相关。通过差异表达蛋白的功能分析,推测①Z24肝毒性的主要作用机制是通过抑制糖有氧氧化、脂酸β氧化及氧化磷酸化途径使ATP产生减少,能量供应不足导致细胞功能障碍,引起细胞死亡,凋亡很可能是Z24引起肝细胞死亡的主要方式;②线粒体脂酸β氧化作用障碍,导致肝细胞内脂质蓄积,是发生肝细胞脂肪变性的原因;③胎球蛋白B和精氨酸代琥珀酸合成酶可作为Z24肝毒性的潜在标志物。Western blot研究结果显示的3α-HSD、GST-P和胎球蛋白B的表达变化与蛋白质组研究结果相一致。Z24对大鼠肝脏细胞凋亡及线粒体功能的影响:按前述方法复制Z24经口染毒致大鼠肝损伤动物模型,取染毒及对照大鼠的肝组织,制备线粒体,检测线粒体的肿胀程度、跨膜电位（ΔΨm）、活性氧（ROS）、NAD（P）H氧化还原状态、游离钙等指标,并采用TUNEL法对肝细胞凋亡进行了原位检测。结果显示,Z24染毒后大鼠肝线粒体内游离钙含量明显增加、ΔΨm下降、ROS产生增多、还原态NAD（P）H减少、线粒体肿胀程度增加、肝细胞凋亡明显增加。结果表明,Z24染毒后可能由于线粒体内钙超载刺激了线粒体渗透转换孔（PTP）开放,导致渗透性转换（MPT）发生,引起ΔΨm下降、ROS产生增多以及线粒体肿胀,诱导了细胞凋亡的发生。Z24对大鼠肝脏抗氧化体系的影响:按前述方法复制Z24经口染毒致大鼠肝损伤动物模型,采用化学比色法检测肝组织匀浆中的丙二醛（MDA）以及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等指标。结果显示,染毒后肝匀浆中GPX活力下降;总-SOD（T-SOD）活力升高,其中主要为CuZn-SOD活力增强,而Mn-SOD活力无明显改变;GST活力明显增高;GSH含量未见下降,反而有所升高,提示肝脏抗氧化能力无明显降低;MDA含量未见明显升高,提示脂质过氧化反应并未明显增强。结果表明,氧化应激损伤反应在Z24肝毒性中不起主导作用。Z24对大鼠肝脏微粒体细胞色素P450（CYP450）酶系的影响:按前述方法复制Z24经口染毒致大鼠肝损伤动物模型,取染毒及对照大鼠的肝组织,差速离心法制备微粒体,检测微粒体内CYP450总含量、细胞色素b5（Cyt-b5）含量、NADPH-CYP450还原酶活性以及CYP1A2、1B1、2E1、3A4等亚型的活性变化。结果显示,Z24染毒后微粒体内CYP450总含量和Cyt-b5含量增高;NADPH-CYP450还原酶活性增强;200mg/kg剂量下CYP1A2和3A亚型的活性增强,但50、100mg/kg剂量下无明显改变;Z24染毒各组CYP2E1和1B1的活性均明显增强。结果提示,Z24染毒可使大鼠肝微粒体CYP450酶系的表达发生改变,Z24对CYP2E1和CYP1B1的诱导效应可能与其肝毒性作用有关。综合分析上述结果,得出以下结论:①Z24对大鼠具有肝脏毒性,血浆生化改变主要为AST、ALP、TBI等水平明显升高;主要病理学改变是肝细胞脂肪变性和纤维组织增生;毒性损伤的主要靶细胞器是线粒体;线粒体内脂酸β氧化障碍,导致肝细胞内脂质蓄积,引起肝细胞脂肪变性。②Z24致大鼠肝毒性的主要作用机制是抑制糖有氧氧化、脂酸β氧化及氧化磷酸化途径,使ATP供应不足,导致细胞功能障碍,引起细胞凋亡;钙离子代谢紊乱引起线粒体PTP的开放可能是Z24诱导肝细胞凋亡的启动途径。③Z24可诱导大鼠肝微粒体CYP450酶系的表达发生改变,对CYP2E1和CYP1B1的诱导效应可能与Z24肝毒性作用有关。④氧化应激反应在Z24致大鼠肝毒性的发生中不占主导作用。⑤血浆中精氨酸代琥珀酸合成酶及胎球蛋白B可作为Z24肝毒性的潜在标志物。