家蚕核型多角体病毒广东分离株空斑克隆株系的建立及其bro基因家族的分析

论文摘要

通过比较NCBI数据库中BmNPV T3株和SC7株的序列得知，不同地区的BmNPV基因组序列存在一定差异，并且大的差异主要位于bro（baculovirus repeated open reading frames）基因家族所在的区域。bro家族是一类在昆虫杆状病毒科中出现的多基因家族，在不同的病毒株中有不同的拷贝，且在碱基序列上也有明显不同。近年来，有关BmNPV bro基因的研究较多，学者们认为bro基因在病毒侵染宿主的过程中具有一定的功能。BmNPV T3株基因组中存在bro-a，bro-b，bro-c，bro-d，bro-e 5个拷贝，它们分布于基因组的三个区域。我们研究发现，BmNPV CQ1株在基因组的第二个区域缺失bro-b基因，GD株在基因组的第三个区域缺失bro-e基因。本研究以BmNPV GD株为研究材料，对其进行了空斑纯化，并对其bro基因家族进行了克隆分析，对bro基因的功能和进化进行了探讨。1．BmNPV GD分离株空斑克隆株系的建立及验证以家蚕胚胎细胞系（BmE-SWU1）为病毒培养载体，利用中性红染色的方法对BmNPV GD株进行了空斑克隆，经扩大培养，获得GD株空斑克隆株系。根据BmNPV CQ1株基因组序列的单核苷酸多态性分析，选出其中SNP位点较多的gcn2（General Control Nonderepressible2）基因，用于验证BmNPV GD株空斑克隆株系的纯粹性。分别从BmNPV GD株和空斑克隆株的基因组中扩增gcn2基因，经T-克隆后测序；将两株病毒的gcn2基因分别进行单核苷酸多态性（SNP）位点分析，发现GD株gcn2基因的潜在SNP位点有2个，而空斑克隆后的病毒株5条gcn2基因序列比较后则未发现多态性位点，说明空斑克隆株经纯化后，病原基因组的纯粹性得到提高，病原得到了纯化。2．bro基因的同源性分析分析bro基因在各病毒株基因组中的分布情况，bro基因主要分布在基因组的三个区域，以T3基因组的bro分布为标准，CQ1株在第二个区域缺失bro-b基因，GD株在第三个区域缺失bro-e基因，而bro-d基因在几株病毒中都存在。以BmNPVGD株空斑克隆株的基因组为模板，扩增出bro-a，RegionⅡ（主要包括bro-b和bro-c基因），bro-d三个片段。与GenBank数据库中BmNPV bro基因序列及本实验室测定的CQ1株的bro基因序列进行比较分析，结果表明BmNPV GD株bro基因存在插入及缺失，bro基因同源性较高，差异主要集中在其氨基酸序列的N端部分。经ANTHEPRO5.0软件预测GD株BRO蛋白均无跨膜区和信号肽。3．bro基因的系统发育分析与功能分析采用邻接法进行的bro基因的系统发育分析表明，GD株bro基因分别位于3个亚组中，GD株bro-d与日本T3株、重庆CQ1株bro-d以及法国SC7株bro-Ⅲ属于亚组A；其bro-a,c与T3株、CQ1株bro-a,c以及SC7株bro-Ⅱ属于亚组B；其bro-b与T3株、CQ1株bro-b,e以及SC7株bro-Ⅰ属于亚组C，C亚组的bro基因与A亚组和B亚组的bro基因具有较大的进化分歧，bro基因进化与地理位置的相关性不明显。根据bro基因在四个不同株系基因组中的位置特征，进一步支持了Kang等的观点：bro-d是BmNPV生存所必需的，bro-a和bro-c相互间功能互补。同时推测bro-b和bro-e功能可能是互补或相同，SC7株的3个bro基因可能是BrnNPV bro家族出现的最简约形式。另外，GD株BRO蛋白N端序列符合前人发现的保守序列模式，但也发现其C端也是高度保守的。在GD株和CQ1株的bro基因中都发现了早期基因启动子结构域C（T）AGT，说明bro基因在病毒感染早期表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 空斑克隆技术的应用
• 1.2 bro基因的研究进展
• 1.2.1 bro基因的来源与分布
• 1.2.2 bro基因的进化
• 1.2.3 BmNPV bro基因的功能研究
• 1.3 生物的遗传多样性及分子检测技术
• 1.4 基因组及基因的进化
• 1.4.1 基因重复
• 1.4.2 水平转移
• 1.4.3 基因分裂与融合
• 1.4.4 外显子重排（exon shuffling）
• 1.4.5 可移动元件（mobile elements）
• 1.5 病毒分子多态性及进化分析
• 1.5.1 同源性分析
• 1.5.2 系统发育分析
• 1.5.3 DNA多态性和分子进化分析
• 第2章 引言
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 研究的主要内容
• 2.2.1 BmNPV GD株的空斑克隆
• 2.2.2 BmNPV GD株空斑克隆株系的验证
• 2.2.3 BmNPV GD株bro基因家族的分析研究
• 2.3 技术路线
• 第3章 BmNPV GD分离株空斑克隆株系的建立及验证
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 BmNPV GD株空斑克隆株系的建立
• 3.3.2 空斑克隆株与GD株gcn2基因的克隆和测序
• 3.3.3 空斑克隆株与GD株gcn2基因的SNP分析
• 3.4 讨论
• 第4章 BmNPV GD株bro基因家族的分析研究
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 BmNPV GD株bro基因的克隆、测序
• 4.3.2 bro基因在BmNPV基因组中的分布
• 4.3.3 bro基因的同源性分析
• 4.3.4 bro基因的系统发育分析
• 4.4 讨论
• 第5章 小结
• 参考文献
• 附录
• 缩略词表
• 在学期间发表的文章及参研课题
• 致谢