透明颤菌血红蛋白基因在产黄青霉中的克隆与表达

论文摘要

本课题主要研究了由天然低氧启动子调控透明颤菌血红蛋白基因（Vitreoscilla hemoglobin gene, vgb）在大肠杆菌及产黄青霉中的克隆与表达特性。 在实验室前期工作的基础上,了解到温度诱导型启动子、蔗糖诱导型启动子等对vgb在大肠杆菌中的诱导表达效果不是很理想。因此从Gene Bank中查到包括vgb天然启动子-低氧启动子的全序列,然后合成了低氧启动子序列连接到vgb结构基因上并克隆到pUC18上,构建了重组质粒pUC18-vgb。为了能将vgb克隆到产黄青霉基因组中,又构建了大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pMK4-vgb（主要是利用其氯霉素抗性筛选基因）,通过SDS-PAGE和CO差光谱分析,证明重组质粒pUC18-vgb、重组穿梭质粒pMK4-vgb在大肠杆菌中均表达出了活性的透明颤菌血红蛋白（VHb）,且明显促进了低氧条件下的菌体生长,生物量提高达15.49%。通过电击转化将重组穿梭质粒pMK4-vgb转入产黄青霉原生质体。利用氯霉素抗性筛选转化子,通过PCR扩增证明vgb已成功重组到了产黄青霉的基因组中,且在缺乏供氧的发酵培养过程中,vgb能在产黄青霉中成功表达。通过从大量菌体中提取并纯化VHb,凝胶电泳检测到VHb条带。发酵实验证明VHb的诱导表达,在低装液量及充分供氧时的发酵过程中,菌体生物量和青霉素发酵效价分别提高9.76%和9.68%。 本研究结果拓宽了vgb的应用范围,为进一步研究vgb在丝状真菌中的克隆与表达特性奠定了基础。本研究结果同时对于其它抗生素产生菌基因工程改造工作具有理论和实际意义。

论文目录

• 第1章 文献综述
• 1.1 产黄青霉概述
• 1.2 产黄青霉的细胞分化与青霉素的生物合成
• 1.2.1 种子培养过程中的菌丝分化
• 1.2.2 发酵培养过程中的菌丝分化
• 1.3 氧气在发酵过程中的重要作用
• 1.4 透明颤菌血红蛋白基因（vgb）及其研究进展
• 1.4.1 透明颤菌的概述
• 1.4.2 VHb的结构
• 1.4.3 vgb基因组成及特点
• 1.4.4 透明颤菌血红蛋白的作用机制和功能
• 1.4.5 vgb基因表达的调控
• 1.4.6 透明颤菌血红蛋白基因的应用
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 抗生素
• 2.1.4 主要用酶
• 2.1.5 Marker
• 2.1.6 主要仪器
• 2.1.7 溶液与试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒载体的制备
• 2.2.2 PCR扩增目的片断
• 2.2.3 载体DNA与目的片断的连接
• 2.2.4 重组质粒转化大肠杆菌DH5α
• 2.2.5 重组子的筛选
• 2.2.6 透明颤菌血红蛋白基因在大肠杆菌中的表达
• 2.2.7 产黄青霉原生质体转化
• 2.2.8 产黄青霉重组子的诱导表达
• 2.2.9 产黄青霉HY876转化子摇瓶发酵试验
• 2.2.10 产黄青霉HY876转化子发酵效价测定
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 质粒pUC-LV的构建
• 3.1.1 质粒pUC-LV的提取与酶切及PCR鉴定
• 3.1.2 大肠杆菌重组子的诱导表达
• 4-LV的构建'>3.2 质粒pMK₄-LV的构建
• 3.2.1 构建方法
• 3.2.2 重组子的诱导表达
• 3.3 vgb在产黄青霉中的克隆与表达
• 3.3.1 产黄青霉原生质体制备情况的检测
• 3.3.2 原生质体电转化方法的建立
• 3.3.3 产黄青霉重组子的筛选
• 第4章 结论
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢