农杆菌介导BADH基因转化马铃薯的耐盐研究

论文摘要

本研究以马铃薯品种费乌瑞它的脱毒微型薯为外植体,利用农杆菌介导法将BADH耐盐相关基因导入马铃薯,经PCR和Southern检测,证明BADH基因己转入马铃薯基因组中。同时对遗传转化的影响因素激素种类与浓度、脱菌抗生素种类与浓度、共培养时间、筛选方式等进行了优化。试验对转BADH基因费乌瑞它进行耐盐性鉴定,结果4个转基因株系与对照相比叶片相对含水量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性三个指标差异显著。主要研究结果如下:1薯块再生培养基确定为MS+1mg/L IAA+2mg/L ZT。2农杆菌菌液浓度为OD600=0.7,侵染时间为5min时,转化效果最佳,费乌瑞它薯块出芽率分别为90.00%,污染率12.50%。3共培养时间对愈伤组织诱导率影响很大,薯块最佳共培养时间为2d。4对脱菌抗生素的浓度进行了比较试验,进口头孢噻肟钠对农杆菌LBA4404菌株有效抑制浓度为200 mg/L,且在有效抑制浓度下对外植体无不良影响,并且可以有效抑制农杆菌的滋生。5试验采用延迟一周的筛选方式,抗性选择剂为草丁磷（PPT）,结果表明薯块芽诱导阶段PPT浓度为5mg/L,生根阶段的PPT浓度为4mg/L。6试验获得抗性植株30株,经PCR检测有10株呈阳性,进一步的Southem杂交出现4株阳性信号,说明基因已经整合到马铃薯基因组中。转BADH基因费乌瑞它后代的生物学鉴定对Southern杂交呈阳性的植株进行抗盐性试验,植株生长期间分别用Nacl浓度为0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的盐水浇灌进行比较试验,植株在Nacl浓度为0.7%时生长正常。生理检测结果表明,转基因株系平均叶片相对含水量比对照高出非转基因植株10.43%,SOD活性比对照高出1.32倍,对照植株MDA含量则高于转基因株系8.87%。综合以上结果,说明BADH基因在4个转基因株系均已表达,提高了马铃薯转基因株系的耐盐性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 土壤盐渍化的概况
• 1.2.2 盐胁迫对植物的影响
• 1.2.3 植物抗盐机理
• 1.2.4 盐碱地的治理
• 1.2.5 植物耐盐基因工程
• 1.2.6 甜菜碱与植物耐盐基因工程
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.1.5 抗生素和激素
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 马铃薯再生体系的建立
• 2.2.2 农杆菌转化外植体的方法及遗传转化体系的优化
• 2.2.3 转化再生植株的分子检测
• 2.2.4 转基因植株的生物学检测
• 3 结果与分析
• 3.1 遗传转化体系影响因素的优化
• 3.1.1 薯块再生培养基的确定
• 3.1.2 农杆菌浓度及侵染时间对马铃薯外植体转化的影响
• 3.1.3 共培养时间对遗传转化的影响
• 3.1.4 脱菌剂浓度的确定
• 3.1.5 PPT 浓度对抗性芽诱导的影响
• 3.1.6 PPT 浓度对抗芽生根的影响
• 3.2 转基因植株的获得
• 3.3 转基因植株的分子检测
• 3.3.1 转基因植株的PCR 分析
• 3.3.2 转基因植株的Southern 杂交
• 3.4 转BADH 基因费乌瑞它后代的生物学鉴定
• 3.4.1 盐胁迫对植株形态的影响
• 3.4.2 盐胁迫对叶片相对含水量的影响
• 3.4.3 盐胁迫对叶片丙二醛含量的影响
• 3.4.4 盐胁迫对叶片超氧化物歧化酶活性的影响
• 3.4.5 转基因植株与对照植株生理指标差异显著性分析
• 4 讨论
• 4.1 薯块再生培养基的确定
• 4.2 农杆菌浓度及侵染时间对遗传转化的影响
• 4.3 共培养时间对遗传转化的影响
• 4.4 脱菌剂的浓度对遗传转化的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 图版
• 图版说明
• 攻读学位期间发表的学术论文