固氮斯氏假单胞菌A1501电子传递复合体基因簇（rnf）的功能研究

论文摘要

生物固氮是个高耗能的过程,每还原一分子的N2消耗16分子的ATP。斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501是一株分离自我国南方水稻根际土壤的联合固氮菌,在无铵和微好氧的条件下能将空气中氮气固定为植物可吸收利用的铵,该菌全基因组已完成序列分析和功能注释。本研究采用生物信息学和分子生物学等技术手段,对A1501编码电子传递复合体的rnf基因簇进行功能鉴定以及表达调控的研究,为探讨和进一步阐明联合生物固氮的分子机制奠定理论基础。本研究根据A1501菌基因组的功能注释,对该菌的中心代谢、能量合成及环境适应性等方面进行了生物信息学分析,结果显示A1501菌具有代谢途径的多样性,除糖酵解（EMP）代谢途径不完整外,包含几乎全部编码Entner-Doudorff途径（ED）、磷酸戊糖途径（HMP）、三羧酸循环（TCA）以及乙醛酸途径中所需酶的基因,这些代谢途径为该菌生长和生物固氮提供所需的能量和还原力。固氮菌的能量产生与电子传递密切相关。序列分析表明,在A1501菌基因组存在三套紧密排列成簇的编码电子传递复合体（1个Nqr和2个Rnf复合体）的基因。其中rnf1基因簇包含7个基因（rnfABCDGEH）,rnf2基因簇包含6个基因（rnfABCDEG）,nqr基因簇包含6个基因（nqrABCDEF）。我们利用pK18mob自杀性载体,通过三亲接合,分别构建了nqr、rnf1和rnf2三个基因簇的极性突变株,生理生化测定的结果表明各基因簇的缺失并不影响细胞的正常生长,但rnf1基因的缺失造成了固氮酶活的显著下降,其突变株的固氮酶活仅为野生型菌株的10%以下;而rnf2,nqr基因簇的极性突变对固氮酶活没有造成任何影响。由于rnf1基因簇位于固氮岛之内,编码的复合体可能负责电子向固氮酶的传递;rnf2,nqr基因簇位于固氮岛之外,编码的复合体则可能与氧化应激反应有关,以适应外界不良环境的刺激。固氮岛内还存在nifF基因,其产物为电子传递中间体,该基因的突变导致细胞的固氮酶活降低到野生型的46.9%,表明在固氮岛内还存在其它未知电子传递补偿途径。为了研究rnf1基因簇的功能,我们分别构建了rnf1基因簇内7个基因的非极性突变株。固氮酶活测定表明任何一个基因的突变均造成了固氮酶活的显著性降低,为野生型菌株的3.4-14.9%,结果表明该基因簇编码一个完整的电子传递体,任何一个基因的缺失都造成rnf1电子传递体结构的破坏,使之不能正确行使电子的传递,从而影响该菌的固氮功能。对rnf基因簇的末端编码蛋白基因rnfH基因进行序列分析,发现其下游基因nifY2,PST1323与rnfH基因的转录方向一致。通过RT-PCR分析表明,rnfH与nifY2,PST1323为同一个转录单元,位于同一个操纵子。斯氏假单胞菌A1501中生物固氮与电子传递密切相关,其rnf1基因簇可能受固氮正调控因子NifA调控。本研究采用细菌单杂技术进一步分析了NifA蛋白与rnf1基因簇启动子的相互作用,结果显示斯氏假单胞菌A1501中NifA蛋白与rnf1基因簇启动子之间存在着相互作用,表明固氮正调控因子NifA调控rnf1基因簇的表达。同时体外凝胶阻滞实验表明NifA蛋白和rnf1基因簇启动子之间存在特异性结合。上述研究结果推断电子传递体Rnfl主要提供了生物固氮过程中所需的能量,编码电子传递体rnf1基因簇的表达是受固氮正调控蛋白所激活的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 编码电子传递体相关基因的研究
• 1.1.1 固氮酶铁蛋白的直接电子供体
• 1.1.2 不同细菌生理学意义上的电子载体
• 1.1.3 铁蛋白电子供体的还原
• 1.1.4 小结
• 1.2 固氮基因的表达调控
• 1.2.1 固氮酶基因的组成
• 1.2.2 NifLA 对固氮基因的调节作用
• 1.2.3 斯氏假单胞菌基因组基本特征
• 1.3 本研究的立题依据
• 第二章 斯氏假单胞菌 A1501 物质代谢及能量生成相关基因的分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株与载体
• 2.1.2 序列分析
• 2.1.3 核酸序列登记号
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 中心代谢
• 2.2.2 能量代谢
• 2.3 结论
• 第三章 斯氏假单胞菌 A1501 固氮相关基因及rnf 基因簇生物信息学分析
• 3.1 实验方法
• 3.1.1 细菌的培养
• 3.1.2 cDNA 基因芯片分析方法
• 3.1.3 蛋白质的预测与跨膜结构分析方法
• 3.1.4 进化树的构建与分析方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 “固氮岛”的组成及固氮相关基因的鉴定
• 3.2.2 电子传递体基因不同条件的表达
• 3.2.3 对rnf 基因簇生物信息学分析
• 3.2.4 系统发育树的构建与序列分析
• 3.3 讨论
• 第四章 电子传递复合体基因rnf 簇的功能研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 酶、试剂及试剂盒
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 A1501 菌株基因组DNA 的分离
• 4.1.5 裂解法小量提取细菌质粒DNA
• 4.1.6 PCR（Polymerase Chain Reaction）
• 4.1.7 PCR 产物的纯化
• 4.1.8 酶切反应
• 4.1.9 连接反应
• 4.1.10 琼脂糖凝胶中DNA 片段的回收
• 4.1.11 β-半乳糖苷酶活性分析试剂
• 4.1.12 β-半乳糖苷酶活性分析
• 4.1.13 菌株固氮活性测定（液体法）
• 4.1.14 乙烯的标定
• 4.1.15 总蛋白的测定
• 4.1.16 极性与非极性突变株的构建
• 4.1.17 细菌总RNA 的提取
• 4.1.18 第一链cDNA 的合成
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 rnfA 插入突变株的构建
• 4.2.2 生长速率的测定
• 4.2.3 固氮酶活的测定
• 4.2.4 各个突变株的蛋白含量的测定
• 4.2.5 rnf1 基因簇与下游基因的关系
• 4.2.6 nifH-lacZ 在野生型和 rnf1 突变株中的表达
• 4.3 讨论
• 第五章 斯氏假单胞菌 A1501 中 NifA 与rnf1 基因簇启动子的相互作用
• 5.1 单杂实验原理
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试剂
• 5.2.2 菌株、质粒和培养条件
• 5.2.3 质粒和基因组DNA 提取
• 5.2.4 nifA 基因的克隆
• 5.2.5 细菌单杂中基因克隆
• 5.2.6 nifA 表达载体的构建
• 5.2.7 细菌单杂系统的载体构建
• 5.2.8 融合蛋白的诱导表达
• 5.2.9 融合蛋白的纯化
• 5.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用溶液及缓冲液
• 5.2.11 蛋白质 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 5.2.12 纯化His-Tag 融合蛋白的NTA 缓冲液的配制
• 5.2.13 细菌单杂实验
• 5.2.14 凝胶阻滞实验
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 启动子区域的分析
• 5.3.2 目的基因片段的克隆
• 5.3.3 重组载体的酶切鉴定
• 5.3.4 细菌单杂
• 5.3.5 融合蛋白 NifA 的表达及蛋白纯化分析
• 5.3.6 NifA 蛋白和rnf1 启动子的结合
• 5.4 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历