论文摘要
根据已知胁迫应答小麦EST序列,从小麦中克隆获得一个ABA应答基因TaRARF基因,该基因存在两个转录本,TaRARF-V1和TaRARF-V2。在完成该基因的结构特点和表达特性分析的基础上,采用农杆菌介导法分别将Ubipromoter启动子驱动的TaRARF-V1、TaRARF-V2基因导入粳稻品种kitaake,获得经分子鉴定证实的转基因水稻植株,并对转基因植株的抗旱性进行研究,主要研究结果如下：1、小麦TaRARF基因的转录表达存在可变剪切采用PCR扩增,从小麦中克隆获得一个ABA应答基因TaRARF （Real ABA Response Functional gene）,该基因全长2490bp,包含8内含子和9外显子。PCR扩增显示,TaRARF含有2个转录本,TaRARF-V1和TaRARF-V2;其中,TaRARF-V1的cDNA全长1072 bp,包含一个长度为870bp,编码289个氨基酸残基的开放阅读框,编码蛋白分子量约为33.16kD,等电点为6.55,属于弱酸性蛋白,该蛋白含有1个跨膜螺旋结构,2个胁迫应答功能域；TaRARF-V2全长1056 bp,编码184个氨基酸,分子量约为20.88 kD,等电点为9.76,属于碱性蛋白,该蛋白含有1个跨膜螺旋结构,1个胁迫应答功能域。2、物种间ItARF基因的可变剪切转录表达存在共性TaRARF的基因组及转录表达可变剪切体TaRARF-V1和TaRARF-V2的序列比对分析显示,两个转录本来源于B族染色体的同一基因,差异在于TaRARF-V2比TaRARF-V1少了16bp；与小麦TaRARF基因类似,水稻和拟南芥的同源基因OsRARF和AtRARF也存在可变剪切体,OsRARF-V1和OsRARF-V2,以及AtRARF-V1和AtRARF-V2,所编码蛋白氨基酸数目分别为289和87,以及276和149。3、小麦TaRARF基因的组织表达及ABA诱导表达具品种特异性组织表达谱分析结果显示,TaRARF基因转录表达具有较强的组织特性,两品种均以叶片中表达量最高,“中国春”的表达量强弱顺序为叶片、茎、籽粒和根,“洛旱2号”表达强弱顺序为叶片、子粒、茎和根,表明TaRARF基因的表达在品种间存在些微差异；苗期不同ABA浓度处理条件下TaRARF转录表达分析结果显示,在“洛旱2号”幼苗阶段TaRARF基因的表达受ABA处理的强烈诱导,02 μmol、0.4 μmol、0.6 μmol、0.8 μmol和1.0μmol的ABA处理条件下TaRARF基因的表达量分别为0μmol处理的1.489、6.035、3.344、3.138和7.499倍,相比之下,品种“中国春”的表达量分别为对照的0.248、0.228、0.201、0.500和0.590倍,呈现抑制作用；半定量分析结果显示,在品种“洛旱2号”幼苗中转录本TaRARF-V1的表达水平高于T aRARF-V2,ABA处理可加急表达量差异,相比之下,品种“中国春”的两转录本TaRARF-V1和TaRARF-V2间的表达量无显著变化。上述结果表明,TaRARF基因对ABA的敏感性在品种间存在显著差异,“洛旱2号”比“中国春”对ABA的敏感性更高。4、超量表达基因载体构建及水稻的遗传转化在构建Ubipromoter启动子驱动的TaRARF-V1和TaRARF-V2基因植物转化载体基础上,采用农杆菌介导法将上述基因导入粳稻品种Kitaake,同时以转空载体为对照,分别获得转TaRARF-V1基因、TaRARF-V2基因和空载体的独立阳性株系31株、45株和15株,特异性PCR鉴定及测序证实外源目的基因已整合进入受体植株基因组。5、过表达aRARF可提高种子萌发期对ABA的敏感性,增强苗期抗旱能力转基因水稻种子萌发期ABA敏感性分析结果显示,超量表达TaRARF-V1、TaRARF-V2能提高转基因水稻苗期生长对的ABA敏感性。苗期抗旱性鉴定结果显示,在供试干旱条件下,转TaRARF-V1植株的存活率介于58.31%～71.43%之间,转TaRARF-V2各株系的存活率介于23.71-28.58%,相比之下转空载体水稻的存活率为0%,过表达TaRARF基因可显著增强转基因水稻的抗旱能力,并以TaRARF-V1的功能更强。MDA含量检测结果显示,干旱处理5d时转TaRARF-V1、转TaRARF-V2和转空载体水稻植株的MDA含量变化量分别为63.6765%,85.432%和305.79%,差异极显著（P≤0.01）；此外,相对失水率同样显示,超量表达转基因株系失水速率极显著小于转空载体CK（P≤0.01）,表明TaRARF基因的导入可增加转基因植株的持水能力。