单链抗体ScFv2F3显示谷胱甘肽硫转移酶活性

论文摘要

可溶性单链抗体的GST 活性研究对工程菌Rose-2F3 进行诱导,表达的目的蛋白部分存在于细胞裂解液的上清中,利用目的蛋白C-末端含有的His6-Tag,用Ni2+金属离子螯合层析柱对其进行粗分,再用高效液相色谱对其进行进一步纯化。利用Western Blot 对所得蛋白质进行了鉴定,证明所得到的蛋白质是目的蛋白scFv2F3,从而得到了可溶性的单链抗体scFv2F3。我们测定了可溶性单链抗体scFv2F3 对多种亲电物质的催化活性,发现它的GST（CDNB）活力为0.997 U/mg,GST（ETHA）活力为0.109 U/mg,GST（对硝基溴苯）活力为3.646 U/mg,GST（CuOOH）活力为0.928 U/mg。结果表明,单链抗体scFv2F3 具有GST 活力。由于它对θ型GST 的特征性底物表现出催化活性,且经过化学修饰和分子模拟,发现其修饰部位是位于scFv2F3CDR2区的SerH52残基,因而可以推断出使单链抗体scFv2F3 具有GST 催化能力的基团是Ser H52残基。另外,我们还以CDNB 为底物对单链抗体scFv2F3 的GST 活性进行了研究。结果表明单链抗体scFv2F3 GST 活力的最适温度为44℃,最适pH 值为pH 7.9。动力学研究结果表明,单链抗体scFv2F3 GST 活性催化反应机制遵循依次反应机制或随机反应机制,它对两种底物的Km 都很低,但kcat值很小。这可能是由于诱导单链抗体scFv2F3 产生的谷胱甘肽衍生物结构与反应产物的结构非常相似造成的,导致产物不能有效释放而延迟了反应的进行。

论文目录

• 第一章 前言
• 一、酶模拟的理论基础
• 二、抗体酶
• 2.1 抗体酶的诞生
• 2.2 抗体酶的制备
• 2.3 抗体酶涉及的领域
• 2.4 抗体酶存在的问题及可能的对策
• 2.5 抗体酶的应用前景
• 三、单链抗体
• 3.1 单链抗体的结构
• 3.2 单链抗体的应用
• 四、谷胱甘肽硫转移酶的结构功能与分类
• 4.1 GST 的解毒作用
• 4.2 GST 的晶体结构
• 4.3 哺乳动物的 GST 的分类
• 4.4 天然 GST 的催化机制
• 五、本论文的设计目的
• 参考文献
• 第二章 可溶性单链抗体的制备
• 一 实验材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 实验仪器
• 1.3 主要溶液的配制
• 二 实验方法
• 2.1 单链抗体的诱导表达
• 2.2 单链抗体的分离纯化
• 2.3 单链抗体的鉴定
• 三 结果分析
• 3.1 单链抗体的诱导表达
• 3.2 单链抗体的分离纯化
• 3.3 单链抗体的鉴定
• 四 讨论
• 本章小结
• 第三章 可溶性单链抗体的 GST 活性研究
• 一 实验材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 实验仪器
• 二 实验方法
• 2.1 结合常数的测定
• 2.2 GST 活力的测定
• 2.3 scFv2F3 的化学修饰
• 2.4 蛋白质含量测定
• 2.5 最适温度和最适pH 值的测定
• 2.6 动力学常数的测定
• 三 结果与讨论
• 3.1 结合常数的测定
• 3.2 单链抗体scFv2F3 的 GST 活力
• 3.3 最适温度和最适pH 值
• 3.4 scFv2F3 的动力学分析
• 本章小结
• 总结
• 参考文献
• 附录一 载体pPelB 图谱
• 附录二 单链抗体scFv2F3 基因序列及其氨基酸序列
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致谢