论文摘要
幽门螺杆菌感染与人慢性胃炎、消化道溃疡和胃腺癌的发病密切相关。一些抗生素可有效杀灭感染的幽门螺杆菌,但存在再次感染和诱导细菌产生耐药性等问题。接种疫苗是预防传染病最为经济和有效的方法,但至今尚无幽门螺杆菌疫苗产品。幽门螺杆菌培养条件苛刻、生长缓慢、产量极低,故基因工程疫苗可能是研发该菌疫苗唯一可行的途径。目前最为肯定的幽门螺杆菌蛋白抗原是尿素酶B亚单位（UreB）和幽门螺杆菌黏附素（HpaA）,其次是空泡毒素（VacA）、细胞毒性相关蛋白（CagA）、中性粒细胞激活蛋白（NapA）、鞭毛蛋白A亚单位（FlaA）和B亚单位（FlaB）等。然而,不同国家和地区同种细菌的优势基因型和抗原表型可有较大差别。本研究中,我们建立了基于幽门螺杆菌重组蛋白抗原rUreB、rHpaA、rVacA、rCagA1、rNapA、rFlaA和rFlaB及其抗体的ELISAs,检测了分离自胃炎或消化道溃疡病人胃黏膜145株幽门螺杆菌临床菌株上述抗原的表达情况,以及145例病人血清中上述抗原的IgG抗体;另采用PCR检测了上述幽门螺杆菌临床菌株中各抗原编码基因携带情况,以期为研制我国幽门螺杆菌基因工程疫苗的抗原选择提供较为充分的依据。实验采用了332例胃炎、消化道溃疡病人胃黏膜活检标本和血清标本,以及35例健康体检儿童的血清标本。采用选择性哥伦比亚血琼脂为分离培养基,通过革兰染色镜检、尿素酶试验和氧化酶试验对分离的幽门螺杆菌进行鉴定。用IPTG诱导rUreB、rHpaA、rVacA、rCagA1、rNapA、rFlaA和rFlaB表达,Ni-NTA亲和层析柱和Western Bolt分别提纯和鉴定目的表达产物。制备上述7种重组表达蛋白抗原的兔抗血清,免疫双扩散法检测其效价。用7种重组蛋白为包被抗原,浓度均为2μg/每孔,以病人血清为一抗、HRP标记羊抗人IgG为二抗,建立检测血清标本中上述抗原IgG抗体的ELISAs。用幽门螺杆菌NCTC11637株及临床分离菌株、10株大肠杆菌和10株金黄色葡萄球菌（阴性对照）的超声波破碎物上清为包被抗原,浓度均为5μg蛋白/每孔,上述7种幽门螺杆菌重组蛋白抗原兔抗血清为一抗、HRP标记羊抗兔IgG为二抗,建立检测幽门螺杆菌临床菌株中上述7种抗原的ELISAs。采用PCR检测幽门螺杆菌临床菌株ureB、hpaA、vacA、cagA、napA、flaA和flaB基因,采用琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。实验结果显示,332例慢性胃炎或消化性溃疡病人胃黏膜活检标本中,幽门螺杆菌分离阳性率为43.8%（145/332）。7种重组蛋白抗原表达量分别约为细菌总蛋白的15%～56%,提纯后经SDS-PAGE后均显示为单一条带并可与幽门螺杆菌全菌抗体形成阳性杂交结果。7种重组蛋白抗原兔抗血清的免疫双扩散效价1:4～1:8。100%（145/145）、86.9%（126/145）、42.8%（62/145）、70.3%（102/145）、89.7%（130/145）、84.8%（123/145）和79.3%（115/145）幽门螺杆菌感染病人血清标本中分别为UreB、HpaA、VacA、CagA、NapA、FlaA和FlaB抗体检测结果阳性。所有幽门螺杆菌临床菌株（100%,145/145）均表达UreB、HpaA、FlaA和FlaB,52.4%（76/145）、91.7%（133/145）和93.1%（135/145）幽门螺杆菌临床菌株表达VacA、CagA和NapA。所有幽门螺杆菌临床菌株（100%,145/145）ureB、hpaA、vacA、flaA和flaB基因PCR结果阳性,96.6%（140/145）和97.9%（142/145）幽门螺杆菌临床菌株cagA和napA基因PCR结果阳性。结论:1.幽门螺杆菌临床菌株7种蛋白抗原基因携带率和表达率有明显差异,ureB、hpaA、flaA、flaB、cagA和napA基因均显示为高携带和高表达状况,vacA基因携带率为100%但表达率仅为52.4%。2.幽门螺杆菌感染的胃炎、消化道溃疡病人血清中UreB抗体阳性率为100%,与幽门螺杆菌临床菌株中编码基因携带率和表达率相符;NapA、HpaA和FlaA抗体阳性率较高（84.8%～89.7%）,但低于幽门螺杆菌临床菌株中编码基因携带率和表达率;VacA和CagA抗体阳性率较低（42.8%,70.3%）,与幽门螺杆菌临床菌株中编码基因高携带率或高表达率之间的差距很大。3.综合上述7种幽门螺杆菌蛋白抗原基因携带、表达及病人血清抗体阳性率检测结果,同时考虑各重组蛋白抗原表达产量差异,我们认为首先是rUreB、其次是rNapA和rHpaA较为适用于幽门螺杆菌基因重组疫苗的候选抗原。