玉米C型胞质雄性不育育性恢复主基因Rf4的精细定位与图位克隆

论文摘要

雄性不育现象在高等植物中普遍存在,雄性不育又可分为核不育、质核互作不育两种类型,其中,由于质核互作不育型能够实现“三系配套”,是生产上应用的主要类型。利用不育系配制玉米杂交种,可以免除人工去雄,降低生产成本;避免因人工去雄不彻底而造成的种子混杂,提高种子纯度;节省雄穗因生长发育而消耗的能量,增加杂交种的产量。根据恢复基因对不育系的育性恢复的专效性原理,可将质核互作雄性不育系分为T、S、C三种类型。CMS-C型为孢子体不育类型,不育系育性高度稳定,是生产上广泛应用的质核互作雄性不育类型,因此明确玉米CMS-C育性恢复机理,克隆其育性恢复基因对该不育类型的应用非常重要。本研究以包含玉米C型胞质雄性不育育性恢复主基因Rf4的87-1近等基因系为材料,通过开发大量多态性的分子标记,对目标基因进行了精细定位,同时通过BAC文库筛选和序列分析,确定了恢复基因Rf4的可能候选基因。本研究取得了以下主要结论:1、利用近等基因系恢复系Cms-ES87-1（Rf4Rf4）和不育系Cms-ES87-l（rf4rf4）构建了回交一代BC1F1群体2,800株,对所有单株进行田间育性观察及花粉镜检,不育单株与可育单株的比例为1︰1,说明研究材料中的育性只受一对基因Rf4控制。2、根据前期研究结果,筛选玉米第8染色体8.00和8.01区已知引物和根据玉米基因组序列设计的BAC-SSR引物,把获得的多态性引物用于筛选分离群体,根据结果进行分析,把恢复基因Rf4定位在引物28-4左侧至短臂端粒处。扩大分离群体的规模至42,200株,同时增加8.00和8.01区分子标记的密度,根据玉米基因组序列,开发了SSR标记、Indel标记、Intron标记等240对,筛选到有多态性的分子标记24对,并用于Rf4的精细定位,其中距离目标基因两侧最近的分子标记是X-21-1与X-33。3、用目标基因两侧的多态性分子标记筛选已构建完成的玉米自交系87-1（Rf4Rf4）的BAC文库,并将包含目的基因的BAC用于测序。根据测序结果分析,标记X-21-1与X-33之间的物理距离约为45,000 Nt。把标记X-21-1与X-33之间碱基序列用FGENESH软件进行基因预测,预测有9个编码基因,并构建了其中3个候选基因的表达载体,用于遗传转化工作。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 综述
• 1.1 玉米雄性不育的研究意义
• 1.2 雄性不育的分类
• 1.2.1 细胞质雄性不育
• 1.2.2 细胞核雄性不育
• 1.2.3 质、核互作型雄性不育
• 1.2.4 质、核互作雄性不育型分类
• 1.3 细胞质雄性不育的败育时期及遗传特点
• 1.4 细胞质雄性不育的恢复基因
• 1.5 雄性不育的恢复机理
• 1.5.1 代谢与互作假说
• 1.5.2 RNA 编辑假说
• 1.5.3 抑制细胞程序性死亡假说
• 1.6 基因克隆方法
• 1.6.1 图位克隆
• 1.7 分子标记的种类及其发展
• 1.7.1 SSR 标记
• 1.7.2 InDel 标记
• 1.7.3 RFLP 标记
• 1.7.4 CAPS 标记
• 1.7.5 RAPD 标记
• 1.7.6 SCAR 标记
• 1.7.7 STS 标记
• 1.7.8 SNP 标记
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 试验设计与田间调查
• 3.3 高质量DNA 的提取和纯化
• 3.3.1 采用改良的SDS 方法提取亲本及群体的DNA
• 3.3.2 DNA 的纯化及质量检测
• 3.4 引物设计
• 3.4.1 BAC-SSR 标记
• 3.4.2 InDel 标记
• 3.4.3 Intron 标记
• 3.5 BSA 法建池
• 3.6 PCR 反应体系
• 3.7 碱裂解法提取种子DNA 的步骤
• 3.8 碱裂解法提取种子的DNA 体系配制
• 3.9 PCR 反应程序
• 3.10 选择性扩增产物检测
• 3.10.1 扩增DNA 变性
• 3.10.2 电泳准备
• 3.10.3 扩增产物的电泳
• 3.10.4 扩增产物的银染检测——聚丙烯酰胺凝胶NaOH 染色方法
• 3.10.5 SSR 分子标记数据的收集
• 3.11 BAC 文库的序列分析及候选基因的预测
• 4 结果与分析
• 4.1 BC1F1 育性的田间调查
• 4.2 恢复基因Rf4 SSR 标记连锁分析
• 4.3 利用开发的分子标记检测交换单株，进行精细定位
• 4.4 BAC 文库的筛选及序列分析
• 5 讨论
• 5.1 分子标记精细定位应注意的问题
• 5.1.1 准确判断表型
• 5.1.2 作图群体和基因定位方法的选择
• 5.1.3 分子标记数据收集和处理应注意的问题
• 5.2 序列多态性与分子标记的开发
• 5.3 玉米CMS 雄性不育育性恢复基因的定位及克隆
• 5.4 B73 与87-1 之间序列之间的差异
• 5.5 进一步的研究工作
• 参考文献
• ABSTRACT