大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pBE2R的构建及应用

论文摘要

本文构建了一个可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中稳定复制,并可以在枯草芽孢杆菌中表达外源蛋白的穿梭表达载体pBE2R。该穿梭表达载体是以pBE2为基本骨架,引入来自pWB980质粒的P43强启动子,并在其下游引入嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽构建而成。质粒拷贝数测定结果显示,pBE2R在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌每个细胞中大约含有1个拷贝。质粒稳定性实验结果显示：该质粒在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中各传30代而不发生丢失,说明该质粒在本实验条件下,可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中稳定存在。利用pBE2R可以实现碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达。以嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因组为模板,据GeneBank报道的碱性蛋白酶基因序列,设计引物,采用PCR技术扩增碱性蛋白酶成熟肽编码基因。连接成熟肽基因与pBE2R,连接产物转化大肠杆菌,提取阳性转化子中质粒转化枯草芽孢杆菌WB600。实验结果显示：嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶可以成功地在枯草芽孢杆菌中进行分泌、表达。pBE2R含有来自枯草芽孢杆菌的P43重叠启动子,可以有效提高外源蛋白的表达量。启动子下游连接有碱性蛋白酶信号肽和前肽编码基因,实验结果表明,信号肽部分可以有效地引导翻译后的外源蛋白完成跨膜分泌；前肽部分作为分子内伴侣,它的存在及其在胞外的正确切除对外源蛋白的折叠,稳定性及功能的发挥起着重要的作用。实验发现,碱性蛋白酶前肽3’末端的一段氨基酸序列‘’TTMA’（从第108位到第111位氨基酸）及其排列顺序对前肽的正确切除起着至关重要的作用,保持TTMA"序列的完整性是前肽正确切除必要条件之一。这一发现为胞外蛋白前肽切除机制的研究奠定了一定的理论基础。pBE2R不仅可以使外源蛋白在枯草芽孢杆菌进行分泌表达,而且也为碱性蛋白酶定向改造提供了高通量筛选平台。将经易错PCR和DNA Shuffling技术获得的碱性蛋白酶成熟肽突变基因与pBE2R连接,连接产物转化大肠杆菌,获得大量克隆,提取其中质粒转化枯草芽孢杆菌,采用酪蛋白平板进行初筛,结合液体发酵液的分光光度法（96孔板）进行复筛,如此重复,经多轮改组和高通量的筛选,最终获得理想的碱性蛋白酶突变基因。据中温α-淀粉酶（来自枯草芽孢杆菌BF7658）利用pBE2R在枯草芽孢杆菌WB600中表达的实验结果推断,碱性蛋白酶长前肽在指导短前肽类蛋白形成功能蛋白方面存在一定的局限性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 原核表达系统概述
• 1.1.1 大肠杆菌表达系统
• 1.1.2 枯草芽孢杆菌表达系统
• 1.2 枯草芽孢杆菌感受态形成机制
• 1.3 枯草芽孢杆菌转化方法概述
• 1.3.1 化学转化法
• 1.3.2 电转化法
• 1.3.3 原生质体转化法
• 1.4 枯草芽孢杆菌表达系统中表达载体概述
• 1.5 穿梭载体的研究现状
• 1.6 本论文的研究内容及意义
• 1.6.1 研究内容
• 1.6.2 研究意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种及质粒
• 2.1.2 工具酶及相关试剂
• 2.1.3 主要仪器和设备
• 2.1.4 培养基及培养条件
• 2.1.5 主要溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法
• 2.2.2 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法
• 2.2.3 SDS-碱抽提法提取质粒方法
• 2.2.4 嗜碱芽孢杆菌基因组提取方法
• 2.2.5 pBE2a的构建
• 2.2.6 pBE2R的构建
• 2.2.7 pBE2R拷贝数的测定
• 2.2.8 pBE2R稳定性测定
• 2.2.9 pBE2R-apr的构建及其在枯草芽孢杆菌中的表达
• 2.2.10 有机溶剂沉淀胞外蛋白方法
• 2.2.11 SDS-PAGE
• 2.2.12 福林酚法测定碱性蛋白酶酶活的方法
• 2.2.13 利用pBE2R构建碱性蛋白酶突变库
• 2.2.14 利用pBE2R在枯草芽孢杆菌中表达中温α-淀粉酶
• 3 结果与讨论
• 3.1 pBE2a的构建
• 3.1.1 P43强启动子的获得
• 3.1.2 pBE2连接大片段的获得
• 3.1.3 pBE2a的构建
• 3.2 pBE2R的构建
• 3.2.1 sp的扩增
• 3.2.2 pBE2R的构建
• 3.3 pBE2R拷贝数测定
• 3.3.1 DH5α/WB600/pBE2R内参基因标准质粒的建立
• 3.3.2 DH5α内参基因拷贝数的测定
• 3.3.3 WB600内参基因拷贝数的测定
• 3.3.4 pBE2R内参基因拷贝数的测定
• 3.4 pBE2R稳定性检测
• 3.4.1 pBE2R在大肠杆菌中的稳定性
• 3.4.2 pBE2R在枯草芽孢杆菌中的稳定性
• 3.5 pBE2R-apr的构建及其在枯草芽孢杆菌中的表达
• 3.5.1 pBE2R-apr的构建
• 3.5.2 pBE2R-apr在枯草芽孢杆菌的表达
• 3.6 与碱性蛋白酶前肽胞外切割密切相关的氨基酸序列的预测
• 3.6.1 插入突变体pBE2a-sp'的构建
• 3.6.2 碱性蛋白酶利用pBE2a-sp'在枯草芽孢杆菌的表达
• 3.6.3 不同插入突变对碱性蛋白酶活性的影响
• 3.7 pBE2R的应用
• 3.7.1 利用pBE2R构建碱性蛋白酶突变库
• 3.7.2 中温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的表达
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 论文发表情况
• 8 致谢