猪骨髓内皮祖细胞的分离、培养及鉴定的优化方案

论文摘要

内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPC）是血管内皮细胞的前体细胞,在生理或病理因素刺激下,可从骨髓被动员到外周血进行损伤的修复。内皮祖细胞又称为血管母细胞（angioblast）,既参与出生后的血管生成（angiogenesis,AG）,同时亦参与机体、器官损伤后的血管再生与修复。血管内皮细胞（endothelial cell,EC）是血液和周围组织的一道屏障,光滑连续的EC层保证了血液中各种细胞在血管里正常的流动,并分泌某些重要的调节因子,如一氧化氮（NitricOxide,NO）等。在正常情况下,体循环中有极少量来源于血管壁的EC,维持其正常水平的更新。而当EC大量损伤时,则无法满足内皮层愈合的需要。近年来多项研究证实,来源于骨髓的EPC能在缺血或血管损伤时动员至体循环中,并募集在缺血或损伤处分化为成熟的EC,形成新生血管。大量的动物和临床实验都已经证明:当组织受到损伤时,尤其是缺血性损伤时,循环及组织中EPC动员和增殖能力增强,并可以在组织内分化为内皮细胞替换功能障碍的内皮细胞、修补裸露的血管内皮损伤区,并参与缺血或损伤组织内新血管生成,从而改善的功能。近年来的研究显示,内皮祖细胞在心脑血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用。且临床上通过EPC移植治疗缺血性疾病获得成功,具有广阔的应用前景。但是无论从骨髓、脐血、胚胎肝和外周血中分离培养出EPC数量都非常有限,不能满足实验研究及临床应用的需要,这是目前限制内皮祖细胞的广泛应用的一个主要原因。因此,探讨如何培养扩增出大量稳定的内皮祖细胞的方法很有必要。本研究将根据内皮谱系细胞的特性,参照国内外多家实验室的培养及鉴定方案,在实验中反复摸索,得出影响EPC培养扩增的主要因素,通过生长曲线及增值倍数对常用分离培养条件及方法进行比较,并予鉴定及功能检测,得出最佳方案。为移植内皮祖细胞在治疗心血管疾病及多器官功能障碍综合症奠定良好的基础。本实验研究共分两部分:第一部分:目的:通过对国内外常用方法的比较建立起小型猪骨髓EPC的标准化分离、培养和扩增的方法,为内皮祖细胞的移植奠定基础。方法:（1）利用无菌技术在猪髂骨抽取骨髓,用密度梯度离心法分离出单个核细胞,并予诱导分化。对不同的培养条件及方法进行分组:A组（按P0接种密度）、B组（按P0换液时间）、C组（按P4代接种密度）、D组（按基础培养液）、E组（按血清浓度）、F组（按包被液）、（按细胞因子浓度）G组（VEGF）、H组（bFGF）、I组（EGF）、J组（IGF）,培养扩增出大量稳定的内皮祖细胞;（2）对原代EPC行细胞集落个数及EPC获得率比较,成熟后EPC通过比较细胞的生长曲线及15天增殖倍数;（3）利用SPSS统计软件,对相关数据进行总结、分析、比较。结果:通过各种不同培养条件及方法得到的EPC细胞形态基本相似,但实施每组各水平细胞的生长速度及增殖情况不一。经统计学分析A、B组,不同水平间均有差异（P＜0.05）,以实施A②、B③方法的原代集落个数生成最多,EPC获得率相对较高。C、D、E、F、G、I、J组中,经统计学分析C、D组,不同水平间均有差异（P＜0.05）,而E组③、④,F组②、③、④,G组④、⑤,H组③、④,I组③、④,J组③、④无明显差异（P＞0.05）,但与其他水平之间均有差异（P＜0.05）;以实施C组②,D组②,E组③、④,F组②、③、④,G组④、⑤,H组③、④,I组③、④,J组③、④的培养的细胞生成曲线每天值均较高,生长趋势较好,在15天内细胞增殖倍数最多。结论:经比较得出最佳培养方案:原代接种密度为1×106/cm2,原代换液时间及方法为接种24h弃贴壁取悬浮细胞接种,48h、72h、96h均换液后取贴壁细胞继续接种培养,P4代及以后接种密度为1×104/cm2,包被液（1%明胶、2%FN、1%明胶和2%FN 1:1）,最佳培养液为M199+10%FBS+VEGF10ng/ml+bFGF50ng/ml+IGF50ng/ml+EG20ng/ml。第二部分目的:鉴定培养扩增出的内皮祖细胞并测定其功能,保证分离及培养扩增细胞的性质及纯度。方法:（1）以Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双色荧光染色法和用CD133、CD34、CD31、KDR等表型表达行免疫组化鉴定EPC及流式细胞仪（FACS）检测EPC纯度;（2）体外血管生成功能试验、迁徙实验、细胞培养液一氧化氮（NO）含量测定分析EPC功能。结果:（1）均行Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双染及免疫组化、流式细胞仪检测CD133、CD34、CD31、KDR等的阳性率符合EPC表型特征;（2）体外血管生成功能试验、迁徙实验阳性,本实验细胞培养液中NO含量明显高于传统普通培养的细胞（P＜0.05）。结论:本研究采用综合的鉴定体系（形态特征、免疫组化、流式细胞仪、双色荧光、体外血管生成功能试验、迁徙实验、一氧化氮（NO）含量测定等）所得结果与国外文献报道一致,完全可证明我们培养扩增的细胞即是EPC。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 小型猪骨髓内皮祖细胞分离、培养及扩增
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 小型猪骨髓内皮祖细胞鉴定及功能检测
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 附录
• 文献综述 内皮祖细胞研究进展
• 参考文献
• 参考文献
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明
• 致谢