毕赤酵母高效发酵生产猪α干扰素过程的优化与代谢调控

论文摘要

本论文以一株表达猪α-干扰素（pIFN-α）的甲醇营养型重组毕赤酵母作为研究对象,从提升pIFN-α表达水平入手,综合运用人工智能技术、在线检测技术、多变量聚类分析、代谢酶学分析等方法,在5 L和10 L规模发酵罐条件下,开展了毕赤酵母高密度流加培养高效表达pIFN-α过程的优化和控制、故障诊断及代谢调控研究。论文主要研究结果如下:（1）将本研究室前人所提出的、基于DO/pH在线测量和人工神经网络模式识别模型的控制系统（artificial neural network pattern recognition based control, ANNPR-Ctrl）应用于两株分别表达pIFN-α和植酸酶的重组毕赤酵母高密度流加培养过程中,并对该控制系统的有效性和通用性进行了验证。研究结果表明,在细胞生长阶段,使用ANNPR-Ctrl控制系统不仅能将流加培养过程中的底物（甘油或葡萄糖）浓度控制在较低水平,而且细胞比增殖速度明显高于传统DO-Stat法,与DO-Stat法相比,相同培养时间内两种重组毕赤酵母的细胞浓度分别提高81%和44%。该控制系统为实现毕赤酵母高密度培养搭建了一个通用平台。（2）利用甲醇电极在线控制甲醇浓度,同时对反映细胞代谢活性的多个状态变量进行同步监测,实时在线地寻找适合pIFN-α表达的最佳诱导条件。研究结果表明,在诱导表达阶段,高而稳定的摄氧速度（oxygen uptake rate, OUR）的形成是实现pIFN-α高效表达的关键因素,其形成不仅需要在诱导期控制甲醇浓度于适中水平（10 g/L）,同时还要对混和（甘油/甲醇）流加培养阶段的细胞比增殖速度进行适度控制,使诱导前的细胞生理功能处于正常状态。在高而稳定的OUR （200-300 mmol/L/h）条件下,pIFN-α最高活性可以达到6.6×106 IU/mL。（3）研究了低温诱导对细胞代谢活性、pIFN-α生产能力和甲醇代谢途径关键酶转录水平的影响。发现:把诱导温度从30°C降低到20°C后,1)细胞对甲醇环境的适应能力明显增强,诱导适应期缩短了近5小时;2)细胞代谢甲醇能力明显增强,不同甲醇浓度水平下的稳定醇氧化酶（AOX）活性、甲醇和氧比消耗速率均大幅提高,约为30°C诱导下的2-3倍;3) 5 L发酵罐下,最高pIFN-α抗病毒活性提高了近10倍;4)甲醇代谢途径关键酶包括解毒酶转录水平是传统30°C诱导时的1.36-16.47倍。（4）重组毕赤酵母发酵生产外源蛋白的过程高度耗氧。从甲醇代谢的角度分析了低温诱导下pIFN-α表达量无法持续提高的深层原因,并在此基础上提出了一种复合诱导（低温+高溶解氧浓度复合控制）策略,该策略通过解除供氧不足、提高NADH使用率和ATP的再生效率,使更多碳流用于pIFN-α蛋白的合成、pIFN-α抗病毒活性可持续提高,最高活性比单纯低温诱导和30°C标准诱导策略下明显提高,达到3.62×107 IU/mL。（5）发酵过程的控制和优化并不能确保发酵生产的高效和稳定。利用30°C诱导时所得到的多批次发酵数据,包括多变量在线检测数据和离线数据,提出了一种简单、直接而有效的多变量聚类分析方法和相应的故障识别/早期预警系统,并对该故障识别和预警系统的有效性进行了验证。以pIFN-α生产性能作为评价指标,将“正常”和“异常”发酵批次下诱导表达期内的多个状态变量以合理的方式组合后,在相应的2维平面图上进行聚类分析,找出“正常”发酵形成的前期条件。根据以上多变量聚类分析的结果,对“正常”和“异常”发酵批次下细胞生长期的重要生理数据进行了反向聚类分析,找出了各“正常”和“异常”发酵批次在细胞生长期内的聚类特征,从而在发酵进入到诱导期之前,即可对发酵是否异常进行预判,可以实现发酵过程的故障诊断和早期预警。（6）在前期研究的基础上,开展了中型发酵罐下毕赤酵母表达pIFN-α的放大研究。研究结果表明,在相同控制条件（甲醇浓度、温度等）下,10 L发酵罐下的pIFN-α抗病毒活性均低于5 L罐下的水平。10 L罐下,降低诱导温度或采用30°C、甲醇/山梨醇共混诱导方式均能提高pIFN-α的表达水平。进一步的代谢酶学分析表明,甲醇/山梨醇共混诱导时,甲醇代谢的能量途径发生了改变,供能途径由甲醇氧化途径转向TCA循环,有利于解除甲醇氧化途径的中间产物甲醛对细胞的毒性作用,30°C诱导下,能量体系运转正常,最高pIFN-α抗病毒活性（1.8×107 IU/mL）超过或接近5 L罐下、20°C诱导及复合诱导（20°C+高溶解氧浓度）时的最高水平,发酵成本下降、整体发酵性能提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 猪α-干扰素国内外研究进展
• 1.2.2 毕赤酵母生产表达外源蛋白的发酵过程
• 1.2.3 毕赤酵母发酵培养基和环境因子的优化
• 1.2.4 毕赤酵母甲醇生长动力学模型
• 1.2.5 毕赤酵母高密度补料培养控制策略
• 1.2.6 人工神经网络模型在发酵过程中的应用
• 1.2.7 发酵过程的多变量聚类分析和故障诊断/早期预警系统
• 1.3 本论文主要研究内容
• 1.3.1 毕赤酵母生产表达猪α-干扰素过程中存在的科学问题
• 1.3.2 毕赤酵母生产表达猪α-干扰素过程中存在的实际问题
• 1.3.3 本论文主要研究内容
• 第二章 基于人工神经网络模式识别的毕赤酵母高密度流加培养控制策略
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要仪器与设备
• 2.2.2 实验菌株
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 分析方法
• 2.2.5 流加控制方法
• 2.2.6 基于人工神经网络模式识别的流加控制策略 （ANNPR-Ctrl）
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 使用ANNPR-Ctrl 系统实现产pIFN-α重组毕赤酵母高密度培养的高效化
• 2.3.2 使用ANNPR-Ctrl 和DO-Stat 法进行流加培养时DO 变化情况的比较
• 2.3.3 使用ANNPR-Ctrl 和DO-Stat 法进行流加培养时底物添加量和流加速度的比较
• 2.3.4 使用ANNPR-Ctrl 实现重组毕赤酵母高密度培养的通用化
• 2.4 本章小结
• 第三章 在线多变量监控改善毕赤酵母表达猪α-干扰素生产性能
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要仪器与设备
• 3.2.2 菌株
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 分析方法
• 3.2.5 发酵罐规模下的诱导条件和在线检测控制系统
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 诱导阶段pIFN-α抗病毒活性和各主要监测变量的变化趋势
• 3.3.2 诱导阶段，不同甲醇浓度控制水平下的pIFN-α抗病毒活性和OUR
• 3.3.3 过渡期的比生长速度对诱导期pIFN-α抗病毒活性和OUR 的影响
• 3.3.4 多批次发酵结果性能比较分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 基于复合型诱导控制策略 （低温+高溶解氧浓度） 的猪α-干扰素优化表达系统
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验菌株
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 降低诱导温度增强细胞对甲醇环境的适应能力
• 4.3.2 诱导温度对AOX 酶活性、细胞代谢活性以及pIFN-α抗病毒活性的影响
• 4.3.3 不同诱导温度下胞内外蛋白酶浓度比较
• 4.3.4 不同诱导温度下甲醛及甲酸脱氢酶活性比较
• 4.3.5 诱导稳定期、不同诱导温度下关键酶基因RT-PCR 定量结果比较
• 4.3.6 甲醇浓度控制在10 g/L 时，不同诱导温度下DO、OUR 和CER 的变化趋势
• 4.3.7 复合诱导 （低温+高溶解氧浓度） 控制提高pIFN-α表达水平
• 4.3.8 不同控制条件下主要性能指标比较
• 4.3.9 低温诱导以及复合诱导 （低温+高溶解氧浓度） 控制提高pIFN-α表达水平代谢机理分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 基于多变量聚类分析的猪α-干扰素表达过程的故障诊断和早期预警系统
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验菌株
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 主要仪器
• 5.2.4 分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 以pIFN-α抗病毒活性为指标对发酵生产性能进行划分
• 5.3.2 “正常” 和 “异常” 发酵批次下，诱导期在线状态变量的2 维平面聚类分析
• 5.3.3 “正常” 和 “异常” 批次下，生长期相关生理变量的2 维平面图聚类分析
• 5.3.4 利用预先得到的“最佳聚类分界线”进行发酵初期的“病态生理诊断”
• 5.4 本章小结
• 第六章 甲醇/山梨醇共混诱导改善中型罐放大生产表达猪α-干扰素生产性能
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 菌株
• 6.2.2 培养基
• 6.2.3 主要仪器
• 6.2.4 分析方法
• 6.2.5 10 L 发酵罐下流加培养和诱导方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 相同诱导条件下，发酵放大前后pIFN-α表达差异比较
• 6.3.2 甲醇/山梨醇共混诱导提高pIFN-α表达水平
• 6.3.3 不同山梨醇流加速度下甲醇和山梨醇消耗情况
• 6.3.4 甲醇/山梨醇共混诱导对AOX 及甲醛异化代谢途径关键酶的影响
• 6.3.5 甲醇/山梨醇共混诱导对TCA 循环中两个关键酶的影响
• 6.3.6 甲醇/山梨醇共混诱导改变毕赤酵母能量代谢途径
• 6.3.7 10 L 发酵罐不同实验条件下各主要发酵性能指标比较
• 6.4 本章小结
• 结论
• 展望
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者攻读博士学位期间发表主要论文