茶树冷驯化过程中基因表达差异的初步分析

论文摘要

茶树原产于热带及亚热带地区，是一种喜温暖，湿润气候条件的植物，其对低温敏感。怎样提高茶树的抗寒性，已日益引起人们的高度重视。日益增加的研究表明，在植物冷驯化过程中所发生的一系列变化是通过低温改变基因表达而引起的，并已克隆了许多相关的基因。而在茶树上，关于冷驯化过程中基因表达情况的变化尚未发现相关研究。研究茶树冷驯化过程中的基因表达变化，揭示茶树抗寒机理，对于茶树种质资源的利用、引种、育种和栽培技术的提高都具有重要意义。本研究以相对电导率为抗寒性指标研究了茶树在冷驯化过程中抗寒性的变化，发现茶树对于温度变化比较敏感，冷驯化过程化中抗寒性变化的大体趋势是随着温度的降低而升高，温度的升高而降低，并且茶树在冷驯化过程中对不同的低温条件作出不同的反应。当外界温度低于生物学温度高于一定低温（4℃）时其具有并维持一定的抗寒性，当外界温度降低至4℃以下时，茶树抗寒性能够继续增强抵御更强的低温伤害。采用mRNA差别显示的方法对3个具有代表性拐点的样品进行研究，结果发现抗寒性不同的样品存在基因差异表达。根据差异片段设计引物，用RT-PCR的方法进行阳性鉴定，共得到15个阳性片段，其中9个表达量增加，5个表达量降低，1个样品2的表达量增加。经过BLAST比对分析，发现这些基因与如下基因同源：nectarinⅢ蛋白基因（3）、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶蛋白家族基因（48）、微管蛋白特异性C伴侣基因（52）、光合系统Ⅱ蛋白D1基因（80、138）、卵磷脂胆固醇酰基转移酶基因（147）、顺式玉米素葡糖基转移酶基因（H4）、核糖体蛋白S14基因（H33）、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶小亚基基因（H44）。15、82和134经比对与葡萄的蛋白同源性较高，但是均为假定的蛋白，没有具体的功能。72、H27和H44经比对没有同源性基因，可能是新基因。根据茶树EST文库选取了6个与植物抗逆相关的EST序列，并设计引物进行RT-PCR分析这几个基因在茶树冷驯化过程中的变化。研究发现除脂肪酸去饱和酶6与抗寒性提高关系不大外，其它几个EST即金属硫蛋白，水分胁迫和ABA诱导的蛋白，Mn-SOD，3-磷酸甘油醛脱氢酶和亲环素均与抗寒性的提高有一定的关系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（Abbreviation）
• 第一章 前言
• 1 植物抗寒分子生物学研究进展
• 1.1 植物抗寒相关基因及其作用
• 1.2 低温驯化的信号转导及其调控
• 2 茶树抗寒性研究进展
• 2.1 茶树抗寒形态结构研究
• 2.2 茶树抗寒生理生化研究
• 3 mRNA差别显示技术在植物学领域的应用
• 3.1 mRNA差别显示技术的基本原理
• 3.2 mRNA差别显示技术的优缺点
• 3.3 mRNA差别显示技术在植物上的应用现状
• 4 研究的目的意义与技术路线
• 第二章 DDRT-PCR分析茶树冷驯化过程中基因表达差异
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料及气象资料
• 1.2 PCR引物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 相对电导率的测定
• 2.2 DDRT-PCR
• 3 结果与分析
• 3.1 茶树冷驯化过程中抗寒性的变化
• 3.2 RNA质量
• 3.3 第一链cDNA质量的鉴定和量的调节
• 3.4 DNA干扰的排除
• 3.5 差别显示结果
• 3.6 cDNA差异条带的回收与重扩增
• 3.7 差异片段的克隆
• 3.8 RT-PCR鉴定假阳性
• 3.9 序列分析
• 4 讨论
• 4.1 茶树冷驯化过程中抗寒性与温度变化的关系
• 4.2 RNA的制备和反转录
• 4.3 引物的选取
• 4.4 差异条带的重扩增
• 4.5 假阳性的排除
• 4.6 阳性片段的序列分析
• 第三章 茶树冷驯化过程中几种基因表达变化的分析
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 主要试剂和仪器
• 2 实验方法
• 2.1 RT-PCR引物的设计
• 2.2 总RNA的提取及检测
• 2.3 cDNA第一链的合成
• 2.4 鉴定cDNA第一链和量的调节
• 2.5 RT-PCR扩增及鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 EST1冷驯化过程中的变化
• 3.2 EST2冷驯化过程中的变化
• 3.3 EST3冷驯化过程中的变化
• 3.4 EST4冷驯化过程中的变化
• 3.5 EST5冷驯化过程中的变化
• 3.6 EST6冷驯化过程中的变化
• 4 讨论
• 第四章 总结与展望
• 1 总结
• 2 展望
• 参考文献
• 附录
• 主要试剂的配制
• 致谢