牡蛎溶菌酶在原核细胞中的高效表达

论文摘要

牡蛎（Oyster）,是一种世界性的贝类,也是我国第一大养殖贝类,广泛分布于辽宁、河北、山东、江苏、浙江、广东、广西、海南等地。牡蛎肉中含有丰富的优质蛋白质,是一种高蛋白低脂肪的优良食品。且还有防治心血管病及抗凝血、降血脂、抗血栓、提高机体免疫等功能。牡蛎养殖业在我国农业经济中具有重要的意义。但是在牡蛎养殖过程中极易发生病害,这将影响我国牡蛎养殖业的发展。牡蛎溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的效应因子,参与机体多种免疫反应,在溶菌过程中形成了一个水解体系,破坏和消除侵入体内的病原,从而实现机体的免疫防御,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的作用,以及具有止血、消肿、防腐和加快组织修复等功能。溶菌酶广泛存在于动植物和微生物中,是一种天然的抗菌剂,能催化N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine, NAG）和N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid, NAM）之间的p-1,4糖苷键的水解,导致细菌细胞壁破裂、内容物逸出而使细菌死亡。溶菌酶对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌有很好的抑菌作用,对人和动物的细胞则不发生溶菌作用,被WHO和许多国家认定为无毒、无害、安全的添加剂,被越来越广泛地应用于医药、食品、生物技术及动物生产等领域。水产动物溶菌酶按其来源分为三类：i型溶菌酶、c型溶菌酶和g型溶菌酶,太平洋牡蛎溶菌酶属于i型溶菌酶。若以牡蛎作为提取牡蛎溶菌酶的原材料,必定牡蛎供应不足且溶菌酶产量低,无法实现工业化生产,而采取DNA重组技术,从原核表达系统中生产牡蛎溶菌酶是解决其供需矛盾的有效途径。本研究以太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）为材料提取总RNA,经RT-PCR扩增太平洋牡蛎溶菌酶基因（称为CgLys基因）的开放阅读框cDNA序列,生物信息软件分析表明,其完整的阅读框全长为414 bp,编码137个氨基酸aa,前20个aa为信号肽,成熟肽由117个aa组成,其分子量为13.2 kDa。通过构建分子系统发育树对其同源性进行分析比较,初步推断该CgLys属于i型溶菌酶。将成熟肽克隆至pMD18-T载体中,经过筛选鉴定后,将重组质粒pMD18T-CgLys进行序列测定。然后将测序正确的基因序列用限制性内切酶BamU I和Sal I双酶切,酶切后的目的基因与通过同样双酶切的表达载体pET-32a（+）连接,从而构建重组质粒pET32a（+）-CgLys并将其转化至大肠杆菌BL21（DE3） pLysS感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达和亲和纯化,得到纯化的重组蛋白CgLys。结果表明,通过SDS-PAGE检测原核表达产物,在18 kDa左右获得了明显的目的条带,且该重组CgLys蛋白主要存在于细菌裂解液的上清液中,即以可溶性蛋白形式存在。上述结果将显著简化后续蛋白纯化过程和难度,为今后扩大规模生产牡蛎溶菌酶奠定了应用基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 牡蛎免疫研究进展
• 1.1.1 软体动物免疫研究进展
• 1.1.2 贝类免疫研究进展
• 1.1.2.1 贝类的细胞免疫
• 1.1.2.2 贝类的体液免疫
• 1.1.2.3 化学递质
• 1.2 溶菌酶研究进展
• 1.2.1 溶菌酶的简介
• 1.2.2 溶菌酶的分类
• 1.2.3 溶菌酶的制备
• 1.2.4 溶菌酶的功能
• 1.3 溶菌酶的应用
• 1.3.1 在食品保藏上的应用
• 1.3.1.1 在乳制品中的应用
• 1.3.1.2 在肉制品保鲜中的应用
• 1.3.1.3 在水果保鲜上的应用
• 1.3.1.4 在其它食品中的应用
• 1.3.2 在医学上的应用
• 1.3.3 在饲料中的应用
• 1.3.4 在生物工程中的应用
• 1.4 溶菌酶的研究意义及展望
• 1.5 外源基因在原核细胞中的表达
• 1.6 课题研究的主要内容、目的、意义和技术路线
• 1.6.1 研究内容
• 1.6.2 研究目的
• 1.6.3 研究意义
• 1.6.4 技术路线
• 1.6.4.1 牡蛎溶菌酶基因的克隆
• 1.6.4.2 牡蛎溶菌酶基因的原核表达
• 第二章 材料与方法
• 2.1 太平洋牡蛎溶菌酶基因的克隆与序列分析
• 2.1.1 材料与仪器
• 2.1.1.1 材料
• 2.1.1.2 菌株与质粒
• 2.1.1.3 特异引物
• 2.1.1.4 主要试剂
• 2.1.1.5 培养基
• 2.1.1.6 常用溶液及缓冲液
• 2.1.1.7 主要仪器
• 2.1.2 方法与步骤
• 2.1.2.1 保守区序列的克隆
• 2.1.2.2 开放阅读框序列的克隆
• 2.1.2.3 表达区序列的克隆
• 2.1.2.4 系统发育树构建
• 2.2 太平洋牡蛎溶菌酶基因在大肠杆菌中的表达研究
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.1.1 质粒与菌株
• 2.2.1.2 酶与试剂
• 2.2.1.3 培养基
• 2.2.1.4 常用溶液及缓冲液
• 2.2.2 方法与步骤
• 2.2.2.1 重组表达载体的构建
• 2.2.2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达
• 2.2.2.3 重组太平洋牡蛎溶菌酶的纯化
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 CgLys基因的克隆与序列分析
• 3.1.1 总RNA检测
• 3.1.2 RT-PCR扩增CgLys保守区序列
• 3.1.3 菌落PCR
• 3.1.4 CgLys保守区序列分析
• 3.1.5 RT-PCR扩增CgLys开放阅读框序列
• 3.1.6 菌落PCR
• 3.1.7 序列比对
• 3.1.8 RT-PCR扩增CgLys表达区序列
• 3.1.9 pMD18T-CgLys重组质粒构建与鉴定
• 3.1.10 重组子序列测定
• 3.1.11 系统发育树的构建
• 3.2 CgLys基因的表达
• 3.2.1 pET32a（+）-CgLys重组子的构建及鉴定
• 3.2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达
• 3.2.3 重组蛋白的纯化
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A
• 附录B
• 附录C