骨髓间充质干细胞促进大鼠IgA肾病修复

论文摘要

研究背景骨髓间质细胞（MSCs）属于成体干细胞的一种,常被称为骨髓来源的成纤维样细胞,能促进细胞更新,修复多种组织损伤。这些细胞在体外特殊培养基中易于分离扩增培养,但缺乏特异性表面标记抗原,常通过其体外贴壁生长的特征,以及可分化为成骨、脂肪、软骨三种重要的基质细胞来鉴定其特异性。目前MSCs被广泛应用,组织工程因而进入一个全新的领域,人们已将MSCs用来修复软骨、骨、肌肉、肌腱、骨髓、肝、脑、心脏及血管等,其中也包括肾脏。当靶器官受到损伤,MSCs能够感应到并移行至损伤处给予功能及结构的修复。虽然其机制尚不明确,但MSCs常被认为是肾脏修复最吸引人的选择。因为肾单位也起源于间质,基质细胞在信号传导中起到了决定性重要作用,这可导致MSCs分化为肾单位和集合管。Morigi等研究了顺铂诱发的急性肾功能衰竭模型:他们注入雄性小鼠骨髓来源的MSCs,明显保护了同基因型雌性小鼠严重的肾小管和肾功能的损害,而且证实包含有Y染色体的MSCs进入了强烈增殖的小管上皮细胞层。在抗Thy1.1肾炎大鼠模型中,检测到输入的骨髓细胞分化为内皮细胞或肾小球系膜细胞。除了干细胞的分化机制,最近一些新的证据提出了可能并有或完全是其他的修复机制。有学者认为MSCs有旁分泌功能,在ARF大鼠模型中,促炎因子（IL-1β,TNF-α,INFγ,iNOS）表达减弱和抗炎因子（IL-10）表达增强,通过免疫调节在ARF的修复中起到重要作用。IgA肾病（IgAN）是一组多病因引起的具有相同免疫病理学特征的慢性肾小球疾病,它是指以IgA或IgA为主的免疫球蛋白弥漫沉积在肾小球系膜区及毛细血管袢,而临床表现和病理改变各异的临床一病理综合征。IgAN的发病机制仍未完全明了,目前认为感染、免疫反应、炎症介质、遗传与其发病相关。不管始动因素如何,有一点是肯定的,它是一组免疫性疾病,在其病情进展中,免疫、炎症因子、细胞外基质积聚等起着重要作用。目前认为在广泛应用肾活检技术的国家,本病是最常见的慢性肾小球疾病。IgAN并非一种良性病变,大约30%的患者于发病后20年出现终末期肾病（ESRD）,是导致慢性肾功能衰竭（CRF）最常见的原因之一。因此,临床上迫切需要可以延缓IgAN进展,减少尿毒症发生的治疗方法。目的鉴于MSCs的临床应用潜能,本研究将体外扩增的异体MSCs输入IgA肾病大鼠体内,观察是否有MSCs归巢于肾内,是否影响IgA肾病的进程,有无治疗作用,并试探讨其可能的机制。方法1.动物分组及模型的建立健康雌性SD大鼠,体重180—200g,均为SPF级,购自南方医科大学动物实验中心。在恒温清洁环境饲养1周后按随机数字表随机选出大鼠分为3组,每组各为12只:1、MSC组:IgA肾病制模成功后,于第11周初每只大鼠尾静脉输注约2×106个MSCs;2、生理盐水（NS）组:制模成功后同期注射0.5ml生理盐水;3、正常对照组:正常饲养对照,不予制模。根据文献及预实验改良,IgA肾病模型的建立采用口服牛血清白蛋白（BSA）+葡萄球菌肠毒素B（SEB）+皮下注射四氯化碳（CCL4）的方法,10周制模成功。2.骨髓MSCs的体外培养和标记取SD雄性大鼠,160g—180g,用全骨髓培养法培养原代细胞。24h后全量换液,以后每3d半量换液,细胞均匀铺满瓶壁（＞80%）接种传代。MSCs传至第5代后每天掺入5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）以标记细胞,每次掺入的终浓度10μmol/l。孵育细胞至80%融合,在输注前30min内收集,用生理盐水悬浮细胞。3.大鼠骨髓MSCs的鉴定MSCs的表面抗原测定:收集第5代细胞,用CD45、CD90直接免疫荧光染色,并设FITC标记的小鼠IgG1作阴性对照,应用流式细胞仪检测。MSCs的成骨成脂诱导分化:MSCs传至第5代,接种至六孔板,制作细胞爬片,细胞孔板内融合后分别加入成脂和成骨细胞诱导液。用Oil Red染色脂肪细胞。用茜素红法和细胞碱性磷酸酶法染色鉴定成骨细胞。4.标本采集每日观察精神、饮食、大小便情况,每周给予称重。于11周末及14周末分别从各组中随机取6只大鼠,麻醉后腹主动脉取全血。均摘取左侧肾脏,取外围的肾皮质一部分做冰冻切片做免疫荧光IgA检测;一部分冻存于液氮,以待提取RNA;余下部分切片留做光镜检查及免疫组化。5.血清学及尿蛋白检测肾功能检测采血后以10%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝,离心分离血清。用全自动生化分析仪测Cr、Bun。尿蛋白检测分别于10周、11周、14周末将各组大鼠装入代谢笼,收集24 h尿,离心取上清。用考马斯亮蓝法检测24小时尿蛋白定量。6.肾组织学检查及损伤评分肾组织经固定、石蜡包埋、切片后,HE、PAS染色行光镜检查,双盲法观察病理组织学改变。利用IPP6.0图像分析软件计算出肾小球系膜区占整个毛细血管丛面积的比值,以此比值的均值进行统计。IgA免疫荧光:新鲜肾组织冰冻切片,滴加山羊抗大鼠的FITC—IgA,荧光显微镜观察摄影。免疫荧光强度分级:参照目前国内外通用的半定量5级法（0～4+）分级:低倍镜下不能显示,高倍镜下似乎可见为一;低倍镜下似乎可见,高倍镜下可见为+;低倍镜下可见,高倍镜下清晰可见为++;低倍镜下清晰可见,高倍镜下耀眼为+++;高倍镜下刺眼为++++。7.TGF-β1、MCP-1细胞因子的检测尿ELISA检测:大鼠24小时尿液中转化生长因子（TGF-β1）和单核/巨噬细胞趋化因子（MCP-1）的含量分别采用相应的ELISA试剂盒检测。免疫组织化学染色:肾组织4μm石蜡切片依据文献方法行免疫过氧化物酶染色。使用下列第一抗体:单克隆小鼠抗大鼠TGF-β1抗体检测组织TGF-β1的表达;多克隆兔抗鼠MCP-1抗体检测组织MCP-1的表达。采用文献提供的半定量法评价肾组织TGF-β1,MCP-1表达的程度。RT-PCR检测肾皮质MCP-1、TGF-β1 mRNA水平的表达:组织液氮保存后,提取总RNA,使用两步法试剂盒进行RT-PCR。2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统扫描,特异性条带用光密度半定量法分析,计算目的基因与GAPDH（内参）光密度的比值。8.观察MSCs在肾脏中的分布使用免疫组化法观察BrdU标记的MSCs在肾脏中的分布情况。高倍镜下分别观察计数肾小球及小管区的阳性细胞,取其平均值作为计数结果。统计分析采用SPSS 11.0版统计软件包,正态分布计量资料用均数±标准差表示。各组之间比较采用析因分析,同一观察时间点各组之间采用单因素方差分析LSD法比较;各组体重及尿蛋白比较采用重复测量数据的方差分析,MSCs在系膜区和小管区的计数比较采用独立样本t检验。P≤0.05有统计学意义。结果1.MSCs的特性原代接种的细胞约12小时后贴壁生长,呈大小不等的圆形。3 d后出现细胞集落;12 d左右集落间相互融合。细胞传至第5代流式细胞仪检测表面抗原CD45-,CD90+。经成脂诱导12d左右,可见含有大量脂滴的脂肪细胞形成,Oil Red染为红色;成骨诱导液诱导14d后,爬片中可见多个钙结节形成,茜素红染为桔红色。细胞碱性磷酸酶法胞浆染色为红棕色。2.动物一般情况及尿蛋白、肾功能改变制模结束时,MSC组和NS组大鼠体重增长较正常组均显著降低,有精神萎靡、食欲减低、嗜睡等症状。第11周,二组体重无显著差异;到第14周末,即输注MSCs4周后,MSC组较NS组体重显著增长（p＜0.05）,精神、食欲好。两组大鼠于第9—10周开始均出现肉眼血尿,MSC组11周后血尿减少,14周后未再出现,而NS组一直存在肉眼血尿。在11周末MSC组尿蛋白及肾功能与NS组比较已有统计学意义（p＜0.05）,且随时间延长更为好转。3.肾脏病理改变与NS组比较,第11周末MSC组大鼠肾小球系膜增生改善无统计学意义（P＞0.05）;至第14周末,MSC组系膜增生程度显著减轻（p＜0.05）,肾小管间质区炎症细胞浸润显著减少;系膜区IgA荧光沉积减少。4.细胞因子的变化ELISA检测显示第11周末MSC组大鼠尿液上清中TGF-β1、MCP-1含量显著少于NS组,至第14周末与正常组比较无统计学差异。RT-PCR结果显示:第11周末肾皮质TGF-β1、MCP-1的mRNA表达MSC组较NS组显著降低。至14周末与正常对照组比较无统计学差异（P＞0.05）。免疫组化显示:TGF-β1、MCP-1在NS组均大量分布在肾小管间质及肾小球系膜区;而在14周末MSC组系膜区基本无TGF-β1、MCP-1分布,小管间质区分布亦显著减少。5.MSCs在肾脏中的分布MSC组免疫组化示BrdU标记的MSCs在第11周末分布在部分肾小球系膜区及肾小管;在14周末仅有极少量阳性细胞存在于系膜区,肾小管及间质中基本未见。结论异体MSCs的移植明显改善了IgA肾病大鼠的肾脏结构和功能,,其修复机制很可能主要是MSCs调节了肾脏内微环境细胞因子的表达,而并不完全依赖于其直接分化为肾脏细胞的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录1 缩略词表
• 附录2 综述
• 附录3 成果
• 致谢