青霉素与乳蛋白的作用及机理的研究

论文摘要

青霉素是目前使用范围最广的用于治疗乳牛疾病的抗生素之一。对乳牛用药后,部分青霉素会残留在牛乳中并形成稳定的静态复合物。使用带有残留青霉素的原料乳,不仅严重影响乳制品的品质,给乳品加工带来经济上的损失：还会使一些具有过敏体质的人群引起过敏反应。同时,如果长期饮用具有抗生素的乳制品,会造成人体内菌群失调,细菌产生耐药性,导致人体免疫力降低。因此,研究青霉素与乳蛋白的结合机理对于乳品安全卫生方面具有着重要的意义。本文应用超滤离心法、荧光光谱法、圆二色光谱法和同步荧光光谱法对青霉素与牛乳蛋白的结合机理进行研究。主要内容包括：1、模拟牛乳的生理环境pH6.6、37℃水浴的条件下,将青霉素分别与脱脂乳、酪蛋白和乳清蛋白混合进行水浴培育,经过超滤离心后使用高效液相色谱测定结合率,并得到了青霉素与脱脂乳、酪蛋白和乳清蛋白分别达到结合平衡需要的时间。从结合率的数值分析出酪蛋白中的α-酪蛋白、β-酪蛋白和乳清蛋白中的牛血清白蛋白是与青霉素结合的主要成分。此外,巴氏杀菌过程对青霉素与脱脂乳的结合没有影响,而超高温灭菌过程会使结合率升高。2、应用荧光光谱法分别分析了青霉素与a-酪蛋白、β-酪蛋白和牛血清白蛋白的相互作用。通过青霉素对蛋白质内源荧光的猝灭作用,按照Stern-Volmer方程和双对数方程分析处理实验数据,比较了不同温度下猝灭速率常数后,确定了青霉素与三种蛋白质均发生了静态猝灭过程形成了稳定的非荧光基态复合物,并得到各自结合反应的结合常数及结合位点数。3、通过修饰Stern-Volmer方程后得到的双倒数方程计算出了青霉素分别与α-酪蛋白、β-酪蛋白和牛血清白蛋白结合作用的热力学参数,并确定了青霉素与牛血清白蛋白和α-酪蛋白的主要作用力为氢键,与p-酪蛋白的主要作用为静电引力。又根据Foster的荧光共振能量转移理论计算出了青霉素与三种蛋白质相互作用的结合距离,并进一步确定了反应过程中静态机理的存在。4、利用同步荧光光谱发现青霉素与牛血清白蛋白和α-酪蛋白作用主要猝灭的是色氨酸残基的荧光,与β-酪蛋白作用主要猝灭的是酪氨酸残基的荧光,并且都会使氨基酸残基的极性和疏水性发生改变。通过圆二色光谱对青霉素与牛血清白蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白结合作用的研究,也证明了青霉素与蛋白质结合会改变蛋白质的构象,进一步说明了青霉素在牛乳会与蛋白质作用形成稳定复合物。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 青霉素
• 1.1.1 青霉素的分类
• 1.1.2 青霉素的结构
• 1.2 青霉素的降解
• 1.2.1 青霉素的化学降解
• 1.2.2 青霉素的生物降解
• 1.3 青霉素类药物的作用机理
• 1.4 青霉素产生抗原的机理和过敏反应
• 1.5 青霉素残留对原料乳加工过程的影响
• 1.6 药物与蛋白质结合的测定方法
• 1.6.1 平衡透析法
• 1.6.2 超滤离心法
• 1.7 药物与蛋白质结合作用机制的研究方法
• 1.7.1 荧光光谱法
• 1.7.1.1 结合常数与结合位点数的确定
• 1.7.1.2 结合距离的计算
• 1.7.1.3 结合作用的热力学参数与作用力的性质
• 1.7.2 同步荧光光谱法
• 1.7.3 圆二色光谱法
• 1.8 本课题的选题依据及主要研究内容
• 第二章 超滤法测定牛乳及其主要乳蛋白与青霉素的结合率
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 溶液配制
• 2.2.1.1 缓冲液的配制
• 2.2.1.2 乳蛋白溶液的配制
• 2.2.2 色谱条件
• 2.2.3 标准曲线的制备
• 2.2.4 超滤法回收率最佳条件的确定
• 2.2.5 测定水浴培育时间对结合率的影响
• 2.2.6 测定巴氏杀菌和超高温灭菌过程对青霉素与脱脂乳的结合率影响
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 高效液相色谱方法的专属性
• 2.3.2 标准曲线
• 2.3.3 超滤条件的选择
• 2.3.4 水浴培育时间的确定
• 2.3.5 巴氏杀菌和超高温灭菌对青霉素与脱脂乳结合率的影响
• 2.4 小结
• 第三章 光谱法实验部分
• 3.1 试剂与仪器
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 溶液的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 荧光光谱
• 3.2.2 量子荧光产率的测定
• 3.2.3 同步荧光光谱
• 3.2.4 圆二色光谱
• 第四章 青霉素与牛血清白蛋白结合作用的光谱研究
• 4.1 结果与讨论
• 4.1.1 荧光光谱
• 4.1.2 结合位点及结合常数
• 4.1.3 结合作用的热力学参数与作用力的性质
• 4.1.4 荧光量子产率的计算
• 4.1.5 结合距离
• 4.1.6 同步荧光光谱
• 4.1.7 圆二色光谱
• 4.2 小结
• 第五章 青霉素与α-酪蛋白结合作用的光谱研究
• 5.1 结果与讨论
• 5.1.1 荧光光谱
• 5.1.2 结合位点及结合常数
• 5.1.3 结合作用的热力学参数与作用力的性质
• 5.1.4 荧光量子产率的计算
• 5.1.5 结合距离
• 5.1.6 同步荧光光谱
• 5.1.7 圆二色光谱
• 5.2 小结
• 第六章 青霉素与β-酪蛋白结合作用的光谱研究
• 6.1 结果与讨论
• 6.1.1 荧光光谱
• 6.1.2 结合位点及结合常数
• 6.1.3 结合作用的热力学参数与作用力的性质
• 6.1.4 荧光量子产率的计算
• 6.1.5 结合距离
• 6.1.6 同步荧光光谱
• 6.1.7 圆二色光谱
• 6.2 小结
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢