嗜水气单胞菌聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控的初步研究

论文题目: 嗜水气单胞菌聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控的初步研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物与生化药学

作者: 胡风庆

导师: 游松,陈国强

关键词: 嗜水气单胞菌,合酶,调控,聚羟基脂肪酸酯,电转化

文献来源: 沈阳药科大学

发表年度: 2005

论文摘要: 利用优化的电转化条件(电场强度为12.5 kV／Cm、脉冲时间为5 ms、电阻1000 O)转化早静止期制备的嗜水气单胞菌WQ株感受态细胞，每微克广泛宿主质粒pBBR1MCS1 DNA可获得约400个具有氯霉素抗性的转化子，质粒DNA在嗜水气单胞菌中可稳定保存。 PCR扩增得到的氯霉素抗性基因被插入到嗜水气单胞茵Ⅰ型PHA合酶基因中间，获得带有Ⅰ型PHA合酶断裂基因的自杀质粒pFH5(6.5 kb)。利用优化的电转化条件，自杀质粒pFH5 DNA转化嗜水气单胞菌感受态细胞，通过细胞内同源重组，氯霉素抗性基因被整合到嗜水气单胞菌细胞的基因组上，获得嗜水气单胞菌Ⅰ型PHA合酶缺失突变株。野生型嗜水气单胞菌仅可利用月桂酸作为碳源合成PHBHHx，高浓度葡萄糖对其生长有抑制作用，而获得的嗜水气单胞菌Ⅰ型PHA合酶缺失突变株具有明显不同于野生型的特点，可以以月桂酸和葡萄糖作为碳源产生中长链PHA(mcl PHA)，表明在野生型嗜水气单胞菌中存在另一个功能被隐藏的Ⅱ型PHA合酶基因。 根据假单胞菌Ⅱ型PHA合酶基因操纵子区保守序列设计引物，以野生型嗜水气单胞菌基因组为模板，PCR扩增得到2.9 kb产物。该区间的DNA序列包含一个1680 bp新的Ⅱ型PHA合酶基因，该基因与假单胞菌Ⅱ型PHA合酶基因具有非常高的同源性，该基因可在恶臭假单胞菌PHA缺失突变株中积累中长链PHA。 嗜水气单胞菌Ⅰ型和新克隆的Ⅱ型PHA合酶同源性比较和氨基酸序列比对表明，新克隆的Ⅱ型PHA合酶与Pseudomonas putida等表现极高的同源性，具有与上述假单胞菌相似的保守区和保守序列。而二者同源性水平很低，表明它们由不同的pha区编码，具有不同的生理特点和底物专一性。 综上所述，野生型嗜水气单胞菌不能利用葡萄糖或月桂酸产生中长链PHA，仅可利用月桂酸作为碳源产生PHBHHx，而Ⅰ型PHA合酶缺失突变株能利用葡萄糖或月桂酸产生中长链PHA，表明中长链PHA合成途径的活化。转录分析表明，在嗜水气单胞菌中Ⅰ型和Ⅱ型PHA合酶基因都可以转录，证明PHBHHx和mcl PHA合成的调节不是在转录水平，Ⅰ型PHA合酶基因的敲除可以活化细胞中功能被隐藏的Ⅱ型PHA合酶。

论文目录:

中文摘要

Abstract

第一章 前言

1.1 聚羟基脂肪酸酯(PHA)简介

1.3 PHA理化性质及可降解性

1.4 PHA的生理功能和应用

1.6 PHA的分子生物学研究

1.7 PHA研究的展望

1.8 本论文的目的与意义

第二章 实验材料与基本实验方法

2.1 材料

2.2 常用实验操作方法

第三章 嗜水气单胞菌电转化研究

3.1 实验目的

3.2 实验背景

3.3 方案设计与可行性分析

3.4 嗜水气单胞菌生长曲线确定和感受态细胞制备

3.5 不同时期制备感受态细胞的电转化研究

3.6 电场强度对嗜水气单胞菌电转化的影响

3.7 脉冲时间对嗜水气单胞菌电转化的影响

3.8 孵育时间对嗜水气单胞菌电转化的影响

3.9 讨论

第四章 中长链PHA在嗜水气单胞菌PHA合酶缺失突变株中的合成

4.1 实验目的

4.2 实验背景

4.3 方案设计与可行性分析

4.4 自杀质粒pFH5构建

4.5 嗜水气单胞菌PHA合酶缺失突变株的获得

4.6 嗜水气单胞菌PHA合酶缺失突变株的鉴定

4.7 嗜水气单胞菌PHA合酶缺失突变株积累PHA研究

4.7 讨论

第五章 嗜水气单胞菌Ⅱ型PHA合酶基因的克隆

5.1 实验目的

5.2 实验背景

5.3 方案设计

5.4 克隆实验

5.5 克隆结果与分析

5.6 PHA合酶基因的功能验证

5.7 讨论

5.8 小结

第六章 嗜水气单胞菌PHA合酶同源性研究

6.1 实验目的

6.2 实验背景

6.3 方案设计

6.4 嗜水气单胞菌Ⅰ型和Ⅱ型PHA合酶的系统分类

6.5 嗜水气单胞菌Ⅱ型PHA合酶氨基酸序列一致性分析

6.6 嗜水气单胞菌Ⅱ性PHA合酶氨基酸序列的multialignment分析

6.7 讨论

第七章 嗜水气单胞菌Ⅰ型和Ⅱ型PHA合酶基因转录分析

7.1 实验目的

7.2 实验背景

7.3 方案设计

7.4 嗜水气单胞菌总RNA提取与纯化

7.5 讨论

7.6 小结

第八章 结论

8.1 嗜水气单胞菌电转化研究

8.2 嗜水气单胞菌Ⅰ型PHA合酶缺失突变株的获得

8.3 嗜水气单胞菌Ⅱ型PHA合酶基因克隆和功能确认

8.4 嗜水气单胞菌PHA合酶同源性分析

8.5 PHBHHx和mcl PHA合成的调节

参考文献

致谢

附录

附录1

附录2

附录3

附录4

附录5

附录6

发布时间: 2006-11-27

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