论文摘要
草坪草具有保持水土、调节气候、美化环境等多种功能,剪股颖作为重要的冷季型草坪草,在公园、城市绿化带和运动场都有着广泛的种植。草坪草容易受到虫害的威胁,尤其是地下害虫蛴螬的危害最为严重,经常造成草坪的斑秃和枯死,大大的降低了草坪的观赏价值和使用价值。苏云金芽胞杆菌cry8类基因是一类对叶甲科、金龟科等多种鞘翅目害虫有毒杀作用的基因,其中cry8Ea1、cry8Ga1分别是从我国自行分离的菌株Bt185、HBF-18中克隆的新基因,分别对金龟科暗黑腮金龟和大黑腮金龟具有特异的杀虫活性。针对cry8类基因抗地下害虫的特点,本研究从构建禾本科植物高效表达载体入手,采用农杆菌介导法将cry8Ea1、cry8Ga1基因分别导入草坪草匍匐剪股颖中,成功获得了转基因抗虫匍匐剪股颖植株。本研究首先利用PCR方法从水稻中克隆了单子叶植物过氧化氢酶CatB基因的启动子（-329到+298）,与GenBank中公布的序列完全一致。然后构建了四个植物表达载体p3300-Ubi-8G（组成型表达启动子Ubiquitin : cry8Ga1基因）、p3300-CatB-8G（根部强表达启动子CatB : cry8Ga1基因）、p3300-Ubi-8E（组成型表达启动子Ubiquitin : cry8Ea1基因）和p3300-CatB-8E（根部强表达启动子CatB : cry8Ea1基因）,通过农杆菌介导法导入到匍匐剪股颖中,经草丁膦筛选得到抗性植株。在得到抗性植株的基础上,进行了分子检测。利用cry8Ea1、cry8Ga1基因检测引物分别进行PCR检测,共得到转p3300-Ubi-8G质粒阳性植株19株,转p3300-CatB-8G质粒阳性植株22株,转p3300-Ubi-8E质粒阳性植株22株,转p3300-CatB-8E质粒阳性植株28株。PCR产物测序结果与cry8类基因吻合,初步证明cry8Ea1、cry8Ga1基因已整合到匍匐剪股颖基因组中,Southern杂交正在进行。对于PCR阳性植株转录水平的分析表明,cry8Ea1、cry8Ga1基因在部分转基因株系中可以正常转录。半定量RT-PCR结果显示,不同株系间的表达量有明显差异,而且由水稻CatB启动子驱动的外源基因在根中的表达量远远大于在叶子中的表达量,后者只有微弱的表达。通过ELISA的检测,确定转基因植株能表达蛋白Cry8Ea1,由CatB启动子驱动的Cry8Ea1蛋白占根中可溶性蛋白的百分比最高可达5.37%。在初步的生物活性测定中,转cry8Ea1基因植株与未转化植株相比接种暗黑鳃金龟幼虫30天后,大部分植株都可以正常生长发育,表现出良好的抗蛴螬的效果。本项研究为抗虫草坪草新品种的大规模选育奠定了坚实的基础,对防治草坪草金龟子虫害和草坪草抗虫新品种培育具有重要的意义。