大豆丝氨酸乙醛酸转氨酶基因克隆、序列分析及转基因植株的抗病性研究

论文摘要

随着植物抗病基因工程的发展,越来越多的抗病基因被人们所发现。2004年,Taler等从印度野生瓜的霜霉病抗性品种中克隆得到两个具有丝氨酸乙醛酸转氨酶（serineglyoxylate aminotransferase,SGT）活性的甜瓜霜霉病抗性基因At1和At2。Taler等发现At1和At2具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性与植物光呼吸途径相关,不属于任何一类已知R基因,对病原菌的抵抗没有种属专化性,并且它们的抗病作用与H2O2相关,基于此种现象,他们提出一种新的抗病机制“酶抗病性”,这是首次报道的通过改变酶的表达量而赋予植物抗病性。据推测At1和At2还可能对霜霉病以外的其它多种植物叶部病害具有抗性作用,是很有研究价值的抗病基因,并且,“酶抗病性”作用机制的提出还需要更多的基因证据和试验支持。据此本论文从光呼吸作用非常强的大豆中克隆At1和At2的同源基因GmSGT,对其进行序列分析、酶活性中心预测、原核表达分析,并将其转入受体植物中进行抗病性鉴定。现将本论文的主要研究结果及创新点总结如下:1.利用大豆EST序列和5’-Race技术,首次从大豆霜霉病抗性品种中克隆了编码丝氨酸乙醛酸转氨酶的GmGGT1基因序列（已获得国家发明专利1项,专利号:ZL2005100887 83.4）,同时从受SA诱导的大豆霜霉病感病品种黑农10号中克隆得到了两条GmSGT1的同源基因GmSGT2,GmSGT3。序列分析表明,GmSGT1与Taler等报道的甜瓜霜霉病抗病基因At1、At2氨基酸序列同源性达88.03%和87.78%;同时,GmSGT1与拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）、水稻（Oryzae sativa L.）、贝母（Fritillariaagrestis）、紫萍（Spirodela polyrrhiza）的丝氨酸乙醛酸转氨酶同源性达83.33%-85.79%。GmSGT1推导蛋白序列分析显示它具有一个5磷酸吡哆醛结合位点GSQKAL和一个强的过氧化物体定位信号SRI,表明该基因可能在植物的过氧化物体中通过光呼吸途径起作用。GmSGT2和GmSGT3与GmSGT1核苷酸序列同源性高达96.38%和99.17%,推导的氨基酸序列同源性为97.03%和99.25%。利用生物信息学方法对GmSGT1,GmSGT2,GmSGT3蛋白的酶学活性中心进行了分析,结果显示三个蛋白序列均具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。2.首次通过存大肠杆菌中模拟植物光呼吸途径的技术,证实了GmSGT1具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。光呼吸途径中发生的反应:乙醇酸（?）H2O2+乙醛酸;乙醛酸（?）甘氦酸。因大肠杆菌中含有乙醇酸氧化酶（GOX）,所以向原核表达菌株中加入乙醇酸,可完成上述反应,通过检测H2O2量的变化,可确定GmSGT1基因的丝氨酸乙醛酸转氨酶功能。本研究结果显示,只有表达GmSGT1蛋白的组分能诱导大量H2O2产生,对照组分无,因此,可以确定GmSGT1具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。3.分析了GmSGT蛋白与大豆不同品种的抗性相关性。Western杂交结果显示,抗霜霉病品种早丰5号和九农9号中可检测到有目的蛋白的表达,而感病品种黑农10号中无表达。SA诱导前、后半定量RT-PCR结果表明,感病品种黑农10号在SA诱导前未检测到表达,而SA诱导后有微量表达,大豆对霜酶病的抗病性也有大幅度提高。因此,我们推断,GmSGH的表达确实和SA诱导途径相关,并且随着GmSGT1表达水平的提高,大豆对霜霉病的抗病性也明显提高。4.构建了GmSGT1植物表达载体,进行烟草转化,获得了转基因植株,并对其进行烟草赤星病,黑胫病,青枯病的抗性鉴定,结果表明转基因烟草显著提高了烟草对赤星病,黑胫病,青枯病的抗性。本研究为Taler等提出的植物“酶抗性基因”提供了新的实验证据。5.利用抗病品种早丰5号探索了GmSGT1基因在大豆中的时空表达特性,该基因在大豆叶片中有表达,而根,茎中无表达,并且随着生育期的增强而表达增强,生殖生长期最强,然后随着细胞的老化而表达减弱,直至消失。这表明GmSGT1的变化趋势与植物光呼吸的变化趋势相符。同时检测了光呼吸途径中在丝氨酸乙醛酸转氨酶上游起作用的乙醇酸氧化酶（GOX）的表达特性,结果表明GOX的表达水平与GmSGT1表达水平的变化具有一致性,说明GmSGT1表达水平提高的同时,它的上游反应也增强,H2O2表达也提高。这与我们推测的GmSGT蛋白在植物光呼吸途径中起作用的结论相符。6.研究确定了大豆遗传转化体系。建立了大豆早丰5号,黑农10号的胚芽尖组培体系,并利用农杆菌LBA4404介导法将构件好的植物表达载体pIM1.1-GmSGT-plus转化早丰5号,RNAi植物表达载体pIM1.1-GmSGT-plusF转化黑农10号,获得了再生植株。同时,对早丰5号的胚芽尖,子叶节,胚轴三种外植体在再生频率,再生时间,K筛选浓度,农杆菌不同侵染时间对重生芽再生频率的影响进行了研究,为早丰5号组培,转化体系的进一步优化提供了实验依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 植物抗病基因研究进展
• 1 植物抗病基因工程
• 2 植物抗病的分子机理
• 3 植物光呼吸作用
• 4 cR基因的研究
• 5 本论文研究的目的和意义
• 第二章 大豆丝氨酸乙醛酸转氨酶（GmSGT）基因的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 GmSGT基因的克隆
• 2.2 GmSGT基因的序列分析
• 2.3 GmSGT二级结构分析
• 2.4 GmSGT三级结构分析和活性中心预测
• 3 小结
• 第三章 大豆丝氨酸乙醛酸转氨酶基因的原核表达及其功能分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 GmSGT1原核表达载体构建
• 2.2 GmSGT1蛋白的原核表达及蛋白纯化
• 2.3 GmSGT1蛋白的抗体制备,ELISA检测及Western杂交
• 2.5 GmSGT1蛋白表达的time cross
• 2.6 GmSGT1蛋白对大肠杆菌生长的影响
• 2.7 GmSGT1蛋白的丝氨酸乙醛酸酶活性分析
• 3 小结
• 第四章 大豆抗、感品种与GmSGT基因相关性分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 大豆霜霉病抗、感品种的霜霉菌诱导
• 2.2 大豆霜霉病抗、感品种的Western检测
• 2.3 大豆不同品种受SA诱导前后GmSGT基因的半定量RT-PCR
• 2.4 大豆不同品种受SA诱导前后GOX基因的半定量RT-PCR
• 2.5 大豆不同部位GmSGT基因的半定量RT-PCR
• 2.6 大豆不同生育期GmSGT基因的半定量RT-PCR
• 3 小结
• 第五章 GmSGT1基因转化烟草及转基因植株抗病性研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 GmSGT1植物表达载体构建
• 2.2 GmSGT1植物表达载体转化烟草
• 2.3 转基因烟草的PCR检测
• 2.4 转基因烟草的Southern检测
• 2.5 转基因烟草的抗病性检测
• 3 小结
• 第六章 大豆遗传转化体系的建立及转GmSGT1基因研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 早丰5号三种外植体重生芽频率比较
• 2.2 早丰5号三种外植体重生芽发生时间比较
• 2.3 大豆早丰5号、黑农10号胚芽尖再生体系的建立
• 2.4 早丰5号三种外植体Kanamycin筛选浓度的确定
• 2.5 GmSGT1植物表达载体构建
• 2.6 不同侵染时间对胚芽尖体系重生芽发生频率的影响
• 2.7 早丰5号,黑农10号转基因再生植株的获得
• 3 小结
• 第七章 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表文章
• 攻读学位论文期间获得国家发明专利
• 附表1
• 附表2