人血浆中RASSF1A基因甲基化定量检测及其初步临床应用

论文摘要

背景人类表观基因组协会（Human Epigenome Consortium）于2003年10月正式宣布开始投资和实施人类表现基因组计划（Human Epigenome Project）。DNA甲基化是基因表观遗传学的重要机制之一,5-甲基胞嘧啶（5′-methylated cytosine,5-mC）甚至被称为第5种碱基。5-甲基胞嘧啶常发生于CpG的背景下,是脊椎动物基因组中最常见的共价修饰碱基。CpG二核苷酸聚集的区域,也就是所谓的CpG岛,广布于基因组内,通常定位于基因启动子区。启动子区CpG的甲基化能导致组蛋白的去乙酰基作用,转录沉默对正常胚胎发育,遗传印迹和X染色体的失活等很重要。近年来,从遗传学到表观遗传学对肿瘤形成的研究日益深入。大量的研究结果证实,抑癌基因的高甲基化失活出现于癌症发生过程的早期,这为寻找新的早期肿瘤诊断的分子生物学标记物提供了新的思路。最近的研究结果提示,与肺癌相关的抑癌基因有20多个,主要有p16、APC、RASSF1A等。因此,检测这些基因启动子部位甲基化可能有助于肺癌的早期诊断。RAS相关区域家族1A（RASSF1A）,是2000年从3号染色体短臂（3p21.3）上克隆出来的新型候选抑癌基因。其具体作用机制尚未完全明确,大多数研究都表明RASSF1A在传导通路和细胞分裂方面均能发挥作用。RASSF1A基因启动子区CpG岛的高甲基化使得其在肺癌细胞系中完全不表达,同时在肺癌组织中可检测到高达40%的甲基化发生率。但是以往研究是针对的肺癌现症患者,而且多数是中晚期肺癌患者。因此,为了研究早期肺癌RASSF1A基因启动子区高甲基化状态,本实验建立了人血浆RASSF1A基因启动子甲基化定量检测的实时荧光定量MSP技术。选择经CT检查发现肺部肿块的肺部疾病患者作为研究对象,结合病理诊断,分析研究早期肺癌病例外周血循环血浆DNA中RASSF1A基因启动子甲基化的发生率,并探讨这一检测在早期肺癌诊断中的临床应用价值。目的建立人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化定量检测的方法,检测早期肺癌患者血浆中RASSF1A基因启动子区甲基化情况。方法大细胞肺癌细胞株NCI-H460经本课题的前期研究被确认为RASSF1A基因启动子区甲基化阳性。以NCI-H460细胞作为甲基化阳性标准样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计准确定量后,再以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆,分别相当于1.5×105、1.5×104、1.5×103、1.5×102、15拷贝甲基化的肿瘤DNA/ml,作为标准品血浆。利用磁珠核酸提取方法从标准品血浆中提取DNA,再对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,设计针对RASSF1A基因启动子区的甲基化引物和探针,确定退火温度和反应体系,建立TaqMan技术的实时荧光定量MSP检测方法,评价该方法的特异性、敏感性和重复性。以1.5×105、1.5×104、1.5×103、1.5×102拷贝甲基化的肿瘤DNA/ml的标准品血浆扩增结果制定定量检测标准曲线,评价该定量检测方法的准确性。对建立的方法学进行进一步优化,改为两步法,并加入质控品。以92例CT检查发现肺部肿块（直径≤2厘米）,并在CT引导下穿刺活检的肺部疾病患者作为研究对象,23例健康人作为阴性对照,以实时荧光定量MSP法检测血浆中甲基化的RASSF1A基因。结果建立了实时荧光定量MSP检测技术,可特异性针对甲基化RASSF1A基因启动子区进行扩增,产物大小为95 bp,并采用以FAM荧光素进行标记的TaqMan探针,极大的提高了检测敏感性。通过调整PC贩应的退火温度（59℃）和体系中Mg2+（25 mmol/L）投入量（2μl）,使整个扩增反应达到最佳。实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测最低限为1.5×102拷贝甲基化的肿瘤DNA/ml。以Ct值计算得出的批内和批间CV分别为1.26%和1.89%。血浆DNA RASSF1A基因甲基化定量检测结果与紫外分光光度法比较,检测差异低于20%。在扩增效率相同的条件下,将反应条件由三步法改为两步法。以1 000μg/ml的H460细胞单克隆株的DNA为质控品,其参照Ct值确定为26.00～28.00。92例CT引导穿刺的肺部疾病患者中,有早期肺癌58例,肺部良性疾病31例和未明确诊断的肺部疾病3例。在58例早期肺癌患者血浆中检测出了25例甲基化（43.1%）,31例肺部良性疾病患者中检出了2例（6.5%）,未明确诊断的3例肺部疾病患者血浆中检出甲基化阳性1例。23例健康人血浆中未检测到RASSF1A甲基化。血浆中RASSF1A基因启动子区甲基化检出率在早期肺癌、肺部良性疾病及健康人之间的差异有统计学意义（p=0.000）,而肺部良性疾病和健康人之间则无差异（p=1.575）。25例早期肺癌病人血浆中甲基化的RASSF1A基因定量结果范围为3.83×102～1.47×105拷贝/ml,中位数为2.90×103拷贝/ml。结论本研究建立了人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化定量检测方法。该方法敏感性高,特异性强,经临床初步检测,其在早期肺癌的诊断中具有重要价值。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 前言
• 实验仪器与试剂
• 第一部分 人血浆中RASSF1A基因甲基化定量检测方法的建立
• 一、材料与方法
• 二、实验结果
• 1 实时荧光定量MSP的反应条件
• 2 实时荧光定量MSP反应体系的优化
• 3 实时荧光定量MSP检测方法的特异性
• 4 实时荧光定量MSP检测方法的敏感性
• 5 实时荧光定量MSP检测方法的重复性
• 6 RASSF1A基因甲基化定量检测的标准曲线及线性范围
• 7 实时荧光定量MSP检测方法的准确性
• 三、分析讨论
• 第二部分 早期肺癌患者血浆中RASSF1A基因甲基化定量检测研究
• 一、材料与方法
• 二、实验结果
• 1 早期肺癌患者血浆中RASSF1A基因甲基化检测结果
• 2 实时荧光定量MSP反应条件的优化
• 3 实时荧光定量MSP中的质控品
• 4 早期肺癌患者血浆中RASSF1A基因甲基化标准曲线法定量检测结果
• 三、分析讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 发表论文