福州市荔枝古树遗传多样性的RAPD分析及离体保存研究

论文摘要

荔枝（Litchi chinensis）在我国栽培历史至少有2000多年,是我国南方特色的热带珍贵果树之一;同时,在我国南方,荔枝还是重要的热带南亚热带风光代表性的风景树,在城市园林绿化和风景区得到广泛应用。古树、名木在园林景观中往往是一道无与伦比的风景线,是历代陵园、名胜古迹的佳景之一,也是一个城市重要的自然和人文景观;古树的基因图谱往往有其特殊性,具有长寿基因和抗性基因以及其他有价值的基因,是植物遗传改良的最宝贵的种质材料。福州市荔枝古树资源丰富,在荔枝史上的占重要地位。鉴于此,我们首先采用RAPD分子标记对福州市荔枝古树资源进行遗传多样性分析,进一步对福州市荔枝古树的核心种质进行离体限制生长保存研究,并采用分子生物学和蛋白组学手段对荔枝古树离体保存机理进行研究。主要研究结果如下:1.福州市荔枝古树遗传多样性的RAPD分析本试验采用RAPD技术对福州市66份荔枝古树资源（含2份据传说是福州西湖“十八娘”古荔枝后代的资源）进行了遗传多样性分析。研究结果表明:16个随机引物共产生232条RAPD带,其中216条为多态性带,占总带数的93.10%,表明66份荔枝古树资源有丰富的多样性。根据扩增条带多态性,利用UPGMA构建了荔枝古树的亲缘关系树状图,遗传距离为0.000-1.000。当D=0.909时,66份荔枝古树资源可以分为3组;当D=0.746时,分为9组;当D=0.578时,可归为18组,福州市区荔枝古树可分为17组,另1组为2份据传说是福州西湖十八娘古荔枝后代的资源。同一地方的荔枝古树基本可以划分在一起,但也有个别划分在不同组,亲缘关系较远,说明福州市区荔枝古树群体存在一定的遗传变异。根据荔枝古树RAPD条带的代表性,结合考虑树龄和知名度等因素,初步确定17个荔枝古树为福州市荔枝古树的核心种质。2.福州市荔枝古树种质资源的离体限制生长保存及体胚发生通过花药培养诱导得到了17个荔枝古树核心种质的胚性愈伤组织（emberyogenic callus, EC）,并确定最佳离体保存方案为:接种量每瓶50 mg,分为3团接种于附加2,4-D1.0 m g?L-1、甘露醇2%、蔗糖20 g?L-1、琼脂8 g?L-1的MS培养基上,在20℃,pH 5.8,暗培养,可以将荔枝古树EC的继代周期延长至125 d。保存后的荔枝古树EC有强烈的体胚发生能力及植株再生能力。遗传稳定性进行RAPD检测表明:限制生长保存后荔枝古树EC的变异率为7.70%。3.福州市荔枝古树EC的GPX活性研究及其基因的克隆以常规继代保存和最佳离体保存的荔枝古树EC为材料,进行了保存过程中GPX活性变化的研究。结果表明:最佳离体保存和常规继代保存下,荔枝古树愈伤组织保存过程中的GPX活性呈规律表达,均出现两个高峰值,说明荔枝古树EC的GPX与维持荔枝古树胚性愈伤组织的离体保存密切相关。第一个GPX酶活性最高值的出现与胚性愈伤组织大量增殖有关,是生长高峰即将到来的标志。第2个GPX酶活性最高值的出现是愈伤组织进入衰老期的象征。但在最佳保存方案下,荔枝古树胚性愈伤组织的两个GPX高峰期的出现要分别比对照（常规继代保存）下迟得多。从西禅寺“宋荔”花药EC克隆获得抗性基因GPX的cDNA和DNA全长。其cDNA开放阅读框大小是507 bp（登录号:FJ172343）;其DNA全长大小是1809 bp（登录号:FJ465145）,由5个外显子和4个内含子组成。同时,应用生物信息学方法分析了GPX基因编码的蛋白质的理化性质、亲疏水特性、二级和三级结构、跨膜结构、结构功能域、信号肽、磷酸化位点预测、模序（Motif）分析、亚细胞定位、分子进化等进行预测分析。4.福州市荔枝古树胚性愈伤组织离体保存过程中蛋白组学研究采用固相pH梯度凝胶双向电泳技术和生物质谱（肽质量指纹谱PMF和串联质谱）技术对常规继代保存过程（15 d、20 d、30 d）中的荔枝古树胚性愈伤组织进行蛋白组学研究,并以常规继代保存30 d的EC和最佳离体保存方案下30 d的EC进行差异蛋白组学研究。（1）荔枝古树EC离体保存过程中蛋白组分、MW和pI变化荔枝古树EC在常规保存过程（15 d、20 d、30 d）和最佳保存方案保存（30 d）中的蛋白组分、MW和pI变化为:①随着培养天数的增加,蛋白点数目变化是先下降后上升趋势,分别为1311、1256、1441个;在最佳保存方案的蛋白点数目少于常规保存的蛋白点数目,仅为1023个,表明在快速生长和接近衰老时期蛋白质合成活跃,而在最佳保存方案则蛋白合成相对较少,处于“休眠”状态。②随着培养天数的增加,小分子量（<15KD）蛋白所占比例呈逐渐减少趋势;在最佳保存方案小分子量蛋白占总蛋白比例明显增加,推测可能小分子量蛋白多是维持胚性愈伤组织正常生长的蛋白。③随着培养天数的增加,pI在4-5之间的蛋白质比例逐渐增加,pI在5-6之间的蛋白质变化幅度较小,pI在6-7之间的蛋白质比例逐渐降低;在最佳保存方案下pI在5-7之间的蛋白点比例增大,特别是pI5-6增加最为明显,pI在4-5之间的蛋白点比例较小,推测维持胚性愈伤组织正常分裂增殖的蛋白pI多集中在5-7之间,衰老或抗衰老氧化蛋白的pI多集中在4-5之间。（2）荔枝古树EC离体保存过程中相关蛋白的质谱鉴定及其功能分析采用串联质谱技术或肽指纹-串联质谱技术方法对双向电泳分离得到离体保存相关蛋白质进行了质谱鉴定,成功鉴定39个蛋白（p<0.05）。鉴定的蛋白可以分为八个功能类群,即氨基酸代谢（1个蛋白）、脂类代谢（2个蛋白）、核酸代谢（2个蛋白）、蛋白代谢与修复（15个蛋白）、细胞组成与信号转导（2个蛋白）、能量和碳代谢（4个蛋白）、胁迫反应与氧化还原（8个蛋白）及功能未知蛋白（5个蛋白）等。成功鉴定蛋白的功能分析表明:荔枝古树EC在常规保存过程中能量和碳代谢相关蛋白的表达呈先降低再升高趋势;信号传导相关蛋白、脂类代谢相关蛋白、氨基酸代谢相关蛋白的表达呈逐渐下降表达趋势;胁迫反应/氧化还原相关蛋白、细胞组成相关蛋白、核酸代谢相关蛋白、蛋白质代谢与修复相关蛋白的表达呈稳定表达状态。荔枝古树EC继代30 d时,胁迫反应/氧化还原相关蛋白、核酸代谢相关蛋白、氨基酸代谢相关蛋白、脂类代谢相关蛋白、蛋白合成相关蛋白在常规保存EC有较强表达,在最佳保存EC则表达较小或不表达;蛋白降解相关蛋白、能量和碳代谢相关蛋白、细胞组成相关蛋白、蛋白修复相关蛋白在最佳保存EC和常规继代EC中表达差异不大;信号传导相关蛋白在最佳保存EC表达量高于常规保存EC。

论文目录

• 缩略词
• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 古树名木保护的研究现状
• 2 植物离体种质保存进展
• 2.1 常规组织培养技术保存种质
• 2.2 限制生长保存法保存研究进展
• 2.3 超低温保存法保存研究进展
• 2.4 植物种质资源离体保存过程中的遗传变异研究
• 3 植物遗传多样性的DNA 分子标记分析
• 3.1 RAPD 标记技术及应用
• 3.2 ISSR 标记技术及应用
• 3.3 SRAP 标记技术及应用
• 4 植物基因同源克隆方法
• 5 蛋白质组学在植物上的应用
• 5.1 蛋白质组学研究内容及支柱技术
• 5.2 蛋白质组学在植物生命活动中的应用
• 6 植物GPX 研究进展
• 7 荔枝生物技术研究进展
• 7.1 荔枝体细胞胚胎发生
• 7.1.1 荔枝胚性愈伤组织的诱导
• 7.1.2 荔枝松散型胚性愈伤组织的筛选与保持
• 7.1.3 荔枝胚性愈伤组织的体胚发生与植株再生
• 7.2 荔枝器官发生
• 7.3 荔枝体细胞胚胎发生的细胞与分子生物学
• 7.4 荔枝种质超低温保存
• 7.5 荔枝遗传多样性DNA 分子标记分析
• 8 本研究的主要内容及意义
• 8.1 本研究的主要内容
• 8.2 研究意义
• 第二章 福州市荔枝古树遗传多样性的 RAPD 分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要实验设备、实验试剂及所需溶液的配制
• 1.2.1 主要实验设备
• 1.2.2 主要试验试剂
• 1.2.3 主要溶液的配制
• 1.3 RAPD 分析方法
• 1.3.1 荔枝古树基因组DNA 的提取
• 1.3.2 荔枝古树基因组DNA 的检测
• 1.3.3 DNA 扩增反应
• 1.3.4 RAPD 反应引物筛选
• 1.3.5 扩增产物的数据分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 荔枝古树基因组DNA 的提取质量
• 2.2 RAPD 引物筛选
• 2.3 荔枝古树资源RAPD 多态性分析
• 2.4 RAPD 标记福州荔枝古树的聚类分析
• 3 讨论
• 3.1 关于RAPD 重复性、稳定性问题
• 3.2 福州市荔枝古树核心种质的构建
• 3.3 福州荔枝古树资源的利用价值
• 3.3.1 福州荔枝古树资源的保护价值
• 3.3.2 福州荔枝古树基因资源的挖掘利用
• 第三章 福州市荔枝古树种质资源的离体限制生长保存
• 第一节 福州市荔枝古树离体保存材料的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 外植体的处理
• 1.2.2 诱导培养基
• 1.2.3 荔枝古树花药愈伤组织的诱导
• 1.2.4 初始诱导愈伤组织的继代保存
• 2 结果与分析
• 2.1 荔枝古树花药培养与愈伤组织的诱导
• 2.2 不同培养基、基因型对愈伤组织诱导的影响
• 3 讨论
• 3.1 花药培养诱导的胚性愈伤组织的来源
• 3.2 影响荔枝花药培养诱导EC 的因素
• 第二节 福州市荔枝古树胚性愈伤组织的离体限制生长保存
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 荔枝古树EC 的限制生长保存的优化
• 1.2.2 荔枝古树EC 继代培养过程中生长曲线的绘制
• 1.2.3 17份荔枝古树核心种质EC的离体保存
• 2 结果与分析
• 2.1 荔枝古树EC 限制生长保存的优化
• 2.1.1 接种量对荔枝古树EC 保存的影响
• 2.1.2 光照强度对对荔枝古树EC 保存的影响
• 2.1.3 光质对对荔枝古树EC 保存的影响
• 2.1.4 蔗糖浓度对对荔枝古树EC 保存的影响
• 2.1.5 琼脂浓度对对荔枝古树EC 保存的影响
• 2.1.6 甘露醇对荔枝古树EC 保存的影响
• 2.1.7 温度对对荔枝古树EC 保存的影响
• 2.2 17 份福州市荔枝古树核心种质EC 的离体保存
• 3 讨论
• 3.1 改变接种量在荔枝EC离体种质保存中的作用
• 3.2 提高渗透压在荔枝EC离体种质保存中的作用
• 3.2.1 蔗糖在荔枝EC 离体种质保存中的作用
• 3.2.2 琼脂在荔枝EC 离体种质保存中的作用
• 3.2.3 甘露醇在荔枝EC 离体种质保存中的作用
• 3.3 温度在荔枝EC 离体种质保存中的作用
• 3.4 延长荔枝EC 保存周期的可能性
• 第三节 福州市荔枝古树EC的体胚发生及植株再生
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 荔枝古树体胚的诱导
• 1.2.2 荔枝古树体胚的成熟与萌发
• 2 结果与分析
• 2.1 不同荔枝古树EC 的体胚发生
• 2.2 荔枝古树体胚的成熟与萌发
• 3 讨论
• 第四节 荔枝古树EC保存前后的遗传稳定性的RAPD检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 仪器与试剂
• 1.3 DNA 的提取与检测
• 1.4 RAPD 反应引物筛选
• 1.5 RAPD 扩增
• 1.6 RAPD 数据分析
• 1.7 限制生长保存前后的变异率
• 2 结果与分析
• 2.1 荔枝古树EC 的DNA 提取质量
• 2.2 荔枝古树EC 离体限制生长保存前后的RAPD 检测
• 3 讨论
• 第四章 福州市荔枝古树 EC 的 GPX 活性变化及其基因的克隆
• 第一节 福州市荔枝古树胚性愈伤组织的GPX活性变化
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试剂的配制
• 1.3 方法
• 1.3.1 GSH 标准曲线的绘制
• 1.3.2 荔枝古树EC 中蛋白质测定、GPX 粗酶液制备及GPX 酶活性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 常规继代保存过程的GPX 活性变化
• 2.2 最佳限制生长保存方案保存过程的GPX 活性变化
• 3 讨论
• 第二节 荔枝古树胚性愈伤组织GPX基因的cDNA及DNA克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 仪器和试剂
• 1.2.1 仪器
• 1.2.2 主要分子生物学及生化试剂
• 1.3 方法
• 1.3.1 荔枝古树胚性愈伤组织GPX 基因cDNA 的克隆
• 1.3.2 荔枝古树愈伤组织总DNA的提取方法和浓度检测
• 1.3.3 荔枝古树胚性愈伤组织GPX基因cDNA的克隆
• 1.3.4 荔枝古树EC基因组DNA GPX基因全长PCR扩增
• 2 结果与分析
• 2.1 荔枝古树EC 基因组总RNA 提取纯度与浓度检测
• 2.2 荔枝古树EC 基因组GPX cDNA 扩增
• 2.3 荔枝GPX 编码基因开放阅读框序列分析
• 2.3.1 荔枝GPX 编码基因开放阅读框核甘酸序列分析
• 2.3.2 荔枝GPX编码基因开放阅读框氨基酸序列分析
• 2.4 荔枝古树EC基因组DNA的提取质量
• 2.5 PCR 扩增反应程序建立和Taq 酶的筛选
• 2.6 荔枝GPX 编码基因内含子分析
• 3 讨论
• 3.1 PCR 反应条件的优化
• 3.2 GPX 基因在荔枝古树EC 离体保存中的作用
• 第三节 荔枝古树GPX基因的生物信息学分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 荔枝古树GPX 编码蛋白质理化性质预测分析
• 2.2 荔枝古树GPX 蛋白的亲疏水特性
• 2.3 保守结构域与功能域分析
• 2.4 荔枝古树GPX 信号肽的预测和分析
• 2.5 亚细胞定位预测
• 2.6 荔枝古树GPX 蛋白的跨膜结构预测
• 2.7 荔枝古树GPX 蛋白质二级结构预测
• 2.8 磷酸化位点预测
• 2.9 模序（Motif）分析
• 2.10 荔枝古树GPX 三维结构的预测和分析
• 2.11 荔枝古树GPX 氨基酸序列的分子系统进化分析
• 3 讨论
• 第五章 荔枝古树EC离体保存中蛋白质组学研究
• 第一节 荔枝古树EC离体保存过程中蛋白质变化的双向电泳分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 仪器与试剂
• 1.2.1 主要仪器设备
• 1.2.2 主要试剂
• 1.3 方法
• 1.3.1 蛋白质样品的提取
• 1.3.2 蛋白质样品的定量
• 1.3.3 荔枝EC 蛋白质样品双向电泳
• 1.3.4 电泳后检测
• 2 结果与分析
• 2.1 离体保存过程中荔枝古树EC 的蛋白数目总体变化
• 2.2 常规离体保存过程中荔枝古树EC 的蛋白变化分析
• 2.3 不同保存方案下荔枝古树EC 保存30 d 的蛋白变化分析
• 2.4 荔枝古树EC 保存过程中凝胶上不同pI 范围蛋白点数目变化
• 2.5 荔枝古树EC 保存过程中凝胶上小于15KD 的蛋白点的变化
• 3 讨论
• 3.1 高分辨率固相pH 梯度凝胶双向电泳技术的应用
• 3.2 荔枝古树EC 在离体保存过程中的蛋白组分变化
• 3.3 离体保存过程中荔枝古树EC 的蛋白质变化与pI 分布的关系
• 第二节 荔枝古树EC 离体保存过程中相关蛋白的质谱鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验仪器
• 1.3 荔枝古树EC 离体保存过程中特异蛋白的质谱鉴定
• 1.3.1 差异蛋白的胶内酶解
• 1.3.2 质谱分析与数据库检索
• 2 结果与分析
• 2.1 荔枝古树离体保存过程EC 相关蛋白的质谱鉴定结果
• 2.2 荔枝古树离体保存过程EC 相关蛋白的功能分析
• 2.2.1 胁迫反应/氧化还原相关蛋白及其功能分析
• 2.2.2 蛋白质代谢与修复相关蛋白及其功能分析
• 2.2.3 核酸代谢相关蛋白及其功能分析
• 2.2.4 氨基酸代谢相关蛋白及其功能分析
• 2.2.5 脂类代谢相关蛋白及其功能分析
• 2.2.6 细胞组成与信号传导相关蛋白及其功能分析
• 2.2.7 能量和碳代谢相关蛋白及其功能分析
• 3 讨论
• 3.1 荔枝古树EC 在常规保存继代过程中相关蛋白的表达规律
• 3.2 最佳保存方案和常规保存下30 d 时荔枝古树EC 相关蛋白表达的差异
• 第六章 小结
• 参考文献
• 附录一 图版及图版说明
• 附录二 66份荔枝古树遗传资源的DNA纯度
• 附录三 荔枝古树GPX 基因的cDNA/DNA 全长序列登录 GenBank 信息及编码蛋白三级结构预测
• 附录四 荔枝古树EC离体保存过程中蛋白质的pI和MW
• 在学期间发表论文
• 致谢