猪圆环病毒2型的检测及皂苷类化合物对核酸疫苗的免疫增强作用

论文摘要

猪圆环病毒（PCV）为无囊膜的单股环状DNA病毒,属于圆环病毒科圆环病毒属,分为1型（PCV1）和2型（PCV2）。PCV2与近年来发生的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）密切相关,还常和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）等混合感染,给养猪业造成巨大的经济损失。迄今还没有可以有效控制PCV2感染的方法。本文从PCV2的PCR检测、序列分析及其与PRRSV混合感染的诊断、皂苷类化合物TSA和TSB对PCV2基因疫苗的免疫佐剂作用等方面进行了研究,研究结果对于深入探索PCV2感染的有效控制方法具有较为重要的意义。1猪圆环病毒2型的PCR检测及其ORF2序列分析建立了一种检测圆环病毒2型（PCV2）的PCR方法。根据GenBank上的基因序列,针对ORF2保守区设计一对引物,用这对引物对临床上疑似多系统衰竭综合症（PMWS）的组织样品进行检测,PCV2阳性的病料中可以扩增出一条692bp的特异性条带,对其它病原的检测结果为阴性。敏感性测定结果表明,该PCR方法可以检测出3.3×10-2μg/ml PCV2 DNA。该方法的建立对于临床上进行PMWS的诊断具有重要意义。根据PCV2 ORF2基因序列设计一对引物,对11头PMWS可疑病猪病料的进行PCR扩增,产物克隆到pMD18-T载体上,得到pT-ORF2。测序后进行比较,结果显示核苷酸同源性为93.3%—100%,氨基酸同源性为91.5%—99.6%。这些基因序列同其它国内（外）PCV2的ORF2序列比较显示,核苷酸和氨基酸的同源性分别为90%—100%和89.3%—99.6%。分子进化分析结果表明,国内流行的PCV2可以分为3群,10个毒株的序列与其它大多数国内毒株和法国毒株形成一个比较大的群,只有1株和国内一些毒株以及荷兰毒株形成一个群,只有少数国内的PCV2与美国、德国、日本、西班牙毒株形成一个小分支。2猪圆环病毒2型与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征混合感染的诊断已有资料表明,PCV2单独感染导致的疾病不会造成大批猪发病或死亡。但是PCV2可以破坏免疫系统,容易继发其它一些病原,如猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟,使疾病复杂化,病情加重,死亡率升高。2001年杭州地区有三个规模化猪场陆续发生仔猪腹泻、保育猪呼吸困难,剖检发现肺部橡皮样,全身淋巴结水肿、部分猪脾脏边缘梗死,发病率、死亡率很高。我们设计了针对PRRSV、PCV2的特异性引物,进行RT-PCR或PCR检测,分别应用伪狂犬（PR）鉴别试剂盒检测和免疫荧光法检测PRV和CSFV,经过比较全面的检查发现这些猪为PCV2合并PRRSV或CSFV感染。3猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光定量PCR检测建立了基于SYBR Green检测PCV2和PRRSV的荧光定量PCR方法。对PCV2和PRRSV的检测下限和上限分别为103和1011拷贝；特异性比较好,不与PCV1、伪狂犬、细小病毒、传染性胃肠炎病毒发生非特异性反应。重复性好,PCV2定量PCR检测的最大批次内的变异系数为0.82%,批次间为1.24%; PRRSV定量PCR检测分别为1.27%和1.74%。通过对80份临床样品（40份来自正常猪,40份来自PMWS猪）的检测,常规PCR方法检测呈PCV2阳性的56份病料荧光定量PCR也为阳性,而常规PCR方法检测PCV2为阴性的24份病料中荧光定量PCR检测为阳性的有12份。对于临床样本的PRRSV检测表明,比常规RT-PCR灵敏度高出10-100倍,检测的10份样品常规方法检出5份阳性,荧光定量方法检出6份为阳性。说明与传统PCR方法相比,荧光方法更加敏感。4皂苷类化合物对猪圆环病毒2型核酸疫苗的免疫佐剂作用为了探讨免疫佐剂对PCV2核酸疫苗的免疫效果,我们以pcDNA3为基础,构建了PCV2的ORF2 （PcO）、ORF2-eGFP （POG）和不含核定位信号序列的ΔORF2 （PcJ）的DNA疫苗,并联合皂苷类佐剂TSA或TSB免疫小鼠2次,DNA疫苗和佐剂每次免疫的剂量分别为100μg和75μg,二免后14天采血用ELISA方法检测特异性IgG及其亚类IgG1和IgG2b;取脾脏以荧光PCR定量检测脾细胞IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10mRNA表达。结果显示,所有重组质粒免疫小鼠的血清特异性IgG、IgGl和IgG2b水平均高于pcDNA3空载体（P<0.05或P<0.01）,3种重组质粒中,以PcJ诱导小鼠产生特异性抗体的作用最显著,说明截短的ORF2的免疫效果优于全长ORF2。重组质粒与TSA或TSB佐剂组的特异性IgG及IgG1的水平均显著高于单纯重组质粒免疫组（P<0.01）；对3种重组质粒免疫小鼠血清特异性抗体的佐剂作用TSA优于TSB, TSA能显著提高3种重组质粒免疫小鼠血清中特异性IgG2b抗体水平（P<0.05或P<0.01）,而TSB仅对PcJ质粒免疫小鼠产生特异性IgG2b有促进作用（P<0.01）,对PcO和POG质粒免疫小鼠血清中特异性IgG2b抗体无显著性影响（P>0.05）。除IL-4以外,重组质粒免疫组脾细胞IL-2、IFN-γ和IL-10 mRNA转录水平显著高于空质粒对照组（P<0.05或P<0.01）；而三种重组质粒间对这些细胞因子的转录水平没有显著差异。佐剂TSA和TSB均可显著增强重组质粒诱导的细胞因子转录（P<0.01）,而且佐剂TSA的作用比TSB强（P<0.01, PcJ对IL-10的组合除外）。上述结果表明TSA和TSB不仅能显著提高重组质粒免疫小鼠血清中PCV2 ORF2特异性抗体水平,显著促进脾淋巴细胞IL-4和IL-10 mRNA转录,而且能够提高脾淋巴细胞IL-2和IFN-γmRNA转录水平。说明TSA和TSB对重组质粒具有良好的免疫佐剂活性,既能显著促进Thl免疫应答,又能显著诱导Th2免疫应答反应。本研究在分析杭州地区PCV2序列特征的基础上,建立了PCV2的荧光定量检测方法,探明了皂苷类化合物（TSA, TSB）对PCV2-DNA疫苗具有免疫促进作用。研究结果为有效控制猪群中的PCV2感染提供了新思路。

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第一部分文献综述

第一章猪圆环病毒2型研究进展

1 一般生物学特征

2 基因结构与功能

3 致病机理（包含免疫学进展内容）

4 PCV2检测方法

5 PCV2与其它病原的关系及疾病模型的复制

6 PCV2免疫防制进展

参考文献

第二章疫苗免疫佐剂的研究进展

1 抗原微粒化佐剂

2 微生物佐剂

3 分子佐剂

4 植物提取物佐剂

5 结语

参考文献

第二部分实验研究

第三章猪圆环病毒2型的PCR检测及其ORF2序列分析

1 材料与仪器

1.1 材料与仪器

1.2 主要试剂

1.3 材料

2 方法

2.1 PCR鉴定方法的建立和应用

2.2 ORF2基因的克隆与序列分析

2.3 ORF2基因的表达

3 结果

3.1 PCR鉴定

3.2 序列分析

3.3 主要抗原基因的表达

4 讨论

4.1 PCR检测方法

4.2 序列分析

4.3 原核表达

参考文献

第四章猪圆环病毒2型与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征混合感染的诊断

1 材料与仪器

1.1 仪器设备

1.2 主要试剂

1.3 病料

2 方法

2.1 引物设计和合成

2.2 肺市脏中RNA的提取

2.3 淋巴结和脾脏中病毒DNA的提取

2.4 PRSV的RT-PCR检测

2.5 PCV-2的PCR检测

2.6 PR野毒检测

2.7 猪瘟抗原检测

2.8 猪瘟抗体检测

2.9 细菌培养

3 结果

3.1 临床症状

3.2 剖检病变

3.3 PRRS的RT-PCR检测

3.4 PCV-2 PCR检测

3.5 CSF抗原检测结果

3.6 细菌培养结果

3.7 猪瘟抗体检测

3.8 PR检测

4 讨论

参考文献

第五章猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光定量PCR检测

1 材料与试剂

1.1 材料

1.2 试剂

2 方法

2.1 引物设计

2.2 PCV2 DNA的提取

2.3 PRRSV RNA提取

2.4 cDNA合成

2.5 SYBR荧光定量参考质粒的构建

2.6 实时定量PCR方法的建立

2.7 数据分析

3 结果

3.1 引物、探针浓度及循环条件的优化

3.2 荧光定量方法的检测限

3.3 荧光定量方法的特异性和重复性

3.4 临床样品的定量PCR检测

3.5 与常规PCR的比较

4 讨论

4.1 荧光定量PCR检测PCV2

4.2 PRRSV的荧光定量PCR检测

参考文献

第六章皂苷类化合物对猪圆环病毒2型核酸疫苗的免疫佐剂作用

1 材料与方法

1.1 主要试剂

1.2 实验动物

2 方法

2.1 核酸疫苗构建

2.2 核酸疫苗的体外表达

2.3 作为核酸疫苗的质粒提取

2.4 佐剂与核酸疫苗的联合免疫

2.5 抗体检测

2.6 细胞因子mRNA的定量分析

3 结果

3.1 核酸疫苗的鉴定

3.2 目的基因在HeLa细胞中的表达

3.3 佐剂对免疫小鼠血清中特异性抗体水平的影响

3.4 佐剂对细胞因子mRNA转录水平的影响

4 讨论

4.1 DNA疫苗

4.2 佐剂对DNA疫苗的促进作用

参考文献

结论与展望

缩略词表

致谢

攻读博士学位期间发表的论文和参加的研究项目

猪圆环病毒2型的检测及皂苷类化合物对核酸疫苗的免疫增强作用

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