论文摘要
第一章反应停对胆囊癌细胞GBC-SD体外抗癌作用目的:探讨反应停对胆囊癌细胞的敏感性及作用和其对细胞周期的影响以及反应停和5-Fu的联合作用。方法:体外培养胆囊癌细胞GBC-SD,采用不同浓度的反应停对胆囊癌细胞进行干预,（1）用MTT法检测各次的抑制率并算出中效浓度,并检测反应停与5-Fu联合作用对GBC-SD细胞的抑制情况;（2）应用台盼蓝拒染法检测细胞生长曲线;（3）应用光学显微镜和电子显微镜观察反应停作用后细胞形态的变化及超微结构变化;（4）用流式细胞仪检测反应停对胆囊癌细胞各周期的影响,并测出细胞凋亡情况。结果:（1）不同浓度的反应停对胆囊癌细胞的抑制率不同,细胞的抑制率与反应停浓度呈剂量依赖性,半数抑制浓度为19.44μmol/L。反应停与5-Fu联合用药对GBC-SD细胞的两药相互作用系数均小于1,20μmol/L的反应停和20μg/ml的5-Fu的两药相互作用系数最小,为0.71。（2）台盼蓝拒染法检测:10μmol/L的反应停干预组细胞出现生长速度稍有减慢,但作用不明显;20μmol/L、40μmol/L的反应停干预组出现活细胞数量下降,细胞明显抑制（P＜0.01）。20μmol/L的反应停能够抑制细胞的生长,第二天表现抑制作用最明显;40μmol/L的反应停能够抑制并直接杀死细胞,表现为第二天后细胞数量没有增加反而减少。（3）反应停作用48小时后用显微镜观察。光学显微镜下可见细胞数目减少;胞浆透亮度下降,细胞体积变小,变圆形。电子显微镜下可见细胞核染色质凝聚深染,内质网、线粒体肿胀,内部结构混乱。并可见核固宿、核碎裂,及凋亡小体的形成等细胞凋亡的表现。（4）流式细胞仪检测发现:①不同浓度反应停作用GBC-SD后G0/G1期所占的比例是不同的,随着反应停浓度的增加,G0/G1期所占的比例逐步上升,而细胞增殖指数（PI）逐步下降。②AnnexinV-FITC/PI双标记法检测,随药物浓度的增加,细胞的凋亡率逐步增加,且差异明显（P＜0.05）;在相同的药物浓度下,24小时的细胞凋亡率明显低于48小时的细胞凋亡率（P＜0.05）。结论:（1）反应停能够抑制胆囊癌细胞的生长,且抑制作用与剂量和时间有关。（2）反应停可以诱导GBC-SD细胞的凋亡,使细胞阻滞于G1期,其作用也与剂量和时间有关。（3）反应停可以和5-Fu联合用药,具有协同效果。第二章反应停对胆囊癌细胞的作用机制研究目的:初步探讨反应停对胆囊癌细胞的作用机制。方法:应用RT-PCR技术检测经反应停作用后胆囊癌细胞中survivin、VEGF、MMP-9的表达。结果:经反应停作用48小时后survivin/β-actin的比值对照组为1.86±0.50、10μmol/L组为1.39±0.43、20μmol/L组为0.36±0.24、40μmol/L组为0.15±0.07,随着反应停作用浓度的增加,survivin mRNA的表达下降;VEGF/β-actin的比值对照组为2.47±0.76、10μmol/L组为1.86±0.61、20μmol/L组为0.89±0.41、40μmol/L组为0.25±0.13,随着反应停作用浓度的增加,VEGF mRNA的表达下降;MMP-9/β-actin的比值对照组为2.16±0.76、10μmol/L组为1.42±0.43、20μmol/L组为0.79±0.32、40μmol/L组为0.31±0.23,随着反应停作用浓度的增加,MMP-9mRNA的表达下降。结论:反应停可能通过促进细胞凋亡和抑制血管生成等机制作用胆囊癌细胞。第三章反应停对胆囊癌细胞作用的蛋白质组学研究目的:筛选反应停治疗胆囊癌细胞后的相关差异蛋白,探讨反应停治疗胆囊癌的机理。方法:应用蛋白质组学技术分离出胆囊癌细胞反应停治疗组和对照组的差异蛋白,并进行分析和鉴定。结果:通过PDQuest软件进行成组比较,在治疗组与对照组间选择差异在两倍以上的蛋白质斑点进行凝胶图谱匹配分析,结果共发现36个差异在两倍以上的蛋白点（p＜0.05）。治疗组中13个表达下调,23个上调。选择其中差异在三倍以上的10个蛋白质斑点作为差异表达的质谱分析。鉴定出7个蛋白质点,在治疗组上调的有:triosephosphate isomerase 1、transgelin 2、neuregulin 3、purine nucleoside phosphorylase;治疗组下调的蛋白质有:heat shock protein 27、phosphoglycerate mutase1、endoplasmic reticulum protein 29。结论:（1）胆囊癌细胞经反应停作用处理后,我们应用蛋白质组学技术分离出36个差异蛋白质点,并鉴定了7个表达差异明显的蛋白质。（2）鉴定得到7个反应停作用相关蛋白质,这些蛋白质都与肿瘤的发生发展有关,通过反应停作用可以改变这些蛋白质的表达,说明反应停在抗胆囊癌细胞方面有一定作用,并可通过这些差异蛋白质点进一步探索反应停对胆囊癌的作用点。为反应停的抗胆囊癌作用机制研究提供线索。（3）反应停作用胆囊癌细胞出现的差异蛋白有多个与磷酸或磷酸化有关,如HSP27、ERp29、PGM1、TPI、PNP、NRG3等,有可能对这些蛋白质进行磷酸化是反应停对胆囊癌细胞作用的一个机制,有待进一步研究。