滇蛙皮肤抗感染多肽的分离纯化、分子克隆及多样性研究

论文摘要

抗菌肽（Antimicrobial peptides,AMPs）是一类小分子多肽（分子量低于10 KDa）,最早因为具有广谱抗菌活性被发现及命名,后来因为不容易诱导微生物产生耐药性而引起世界范围内的广泛关注。随着研究的不断深入,人们发现:抗菌肽是先天免疫最终效应物之一,在防御和消除外来病原体（细菌、真菌、病毒、原虫等）对机体的侵袭和破坏、维持机体正常的生理机能等方面发挥重要的作用,是炎症反应、免疫激活和创伤愈合等过程中的重要活性因子。在植物、动物（昆虫、两栖类、人类）、甚至微生物体内都发现有抗菌肽（样）的存在。抗感染多肽（Anti-infective peptides）概念的提出,对抗菌肽在名称上进行了功能性的修正。两栖类皮肤分泌液是抵御微生物侵染的第一道防御屏障,自1987年Zasloff等人从非洲爪蟾皮肤中分离到Magainin以来,各国学者对两栖类皮肤分泌液的研究越来越广泛和深入起来。滇蛙（Rana pleuraden）,是我国特有种之一,主要分布在我国云南、贵州、四川等地,药用及经济价值尚未被发掘,有广阔的开发利用空间。在本论文中,我们利用生物化学及分子生物学的手段对滇蛙皮肤的抗感染多肽进行了研究。通过两步法（Sephadex G-50和RP-HPLC）对滇蛙皮肤分泌液的成分进行分离纯化,我们得到2种具有抗菌活性的多肽,命名为pleurain-A1和pieurain-A2.Edman降解法测定其全序列,分别是SIITMTKEAKLPQLWKQIACRLYNTC和SIITMTKEAKLPQSWKQIACRLYNTC.运用基质辅助激光解离离子化技术（MALDI-TOF-MS）测定其分子量分别为3048.5 Da和3024.8 Da。使用CLONTECH公司的CreatorTMSMARTTM cDNA Library Construction Kit构建了滇蛙皮肤的cDNA文库,根据蛋白序列比对,以相近的抗茵肽信号肽N端序列设计引物序列,我们从滇蛙皮肤抗感染多肽亚克隆文库中,筛选得到135条由抗菌肽信号肽编码的抗感染多肽cDNA核酸序列（GenBank accession no.:EF613243-EF613259,EF621707-EF621709,EU138029-EU138143）,编码34种多肽,分属于12个抗菌肽家族,pleurain-As（4个）,pleurain-Bs（4个）,pleurain-Cs（2个）,pleurain-Ds（6个）,pleurain-E（1个）,pleurain-F（1个）,pleurain-Gs（9个）,pleurain-Js（2个）,pleurain-K（1个）,Lividin-RP（1个）,pleurain-Ms（2个）,pleurain-N（1个）。对这些抗感染多肽的分子多样性进行研究发现,这12个家族的抗菌肽前体序列的SPD区域（Signal and PropieceDomain,SPD）非常保守,Mega及DAMBE分子遗传分析表明,它们可能起源于同一个祖先基因。对其进行同义突变率及错义突变率检测发现,它们可能经受着不同的选择压力。随机选取10个家族的抗感染多肽进行人工合成,研究其生物学功能多样性发现:pleurain-A1,pleurain-D4,pleurain-G7,pleurain-M1具有广谱的抗微生物活性,pleurain-J1表现出较窄的抗菌谱（抗金黄色葡萄球菌）,而其他家族的肽类物质并不直接具有杀死微生物的能力。同一家族的抗感染多肽pleurain-G1和pleurain-G7表现出明显不同的抗茵活性,pleurain-G1的抗茵肽活性本实验过程中未检测到。此外,我们还发现这10个家族的抗感染多肽普遍具有促进组胺释放、促进肥大细胞脱粒、凝集红细胞、清除自由基等免疫相关生物学活性的一种或几种,预示着抗菌肽（样）的存在可能跟机体免疫反应密切相关。随着对抗菌肽研究的不断深入,人们对机体先天免疫有了更进一步的理解和认识。本研究为寻找新型传统抗生素替代药物——抗菌肽（抗感染类）药物提供了更多的设计模板。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词对照表
• 第一章 文献综述
• 一.两栖类抗菌肽综述
• 1.抗菌肽的理化性质
• 2.抗菌肽的分类及分子结构
• 3.抗菌肽的作用机制模型
• 4.抗菌肽表达的调控机制
• 5.微生物对抗菌肽的逃避机制
• 6.抗菌肽的生物学功能
• 7.抗菌肽在医疗卫生方面的研究进展
• 二.蛙属两栖类抗菌肽的研究进展
• 参考文献
• 第二章 滇蛙皮肤分泌液抗菌活性物质的初步研究及其皮肤cDNA文库的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、试剂及仪器
• 1.2 两栖类动物处理和样品收集方法
• 1.3 抗菌活性检测
• 1.4 滇蛙皮肤cDNA文库的构建
• 2.结果与分析
• 2.1 抗菌活性检测
• 2.2 cDNA文库构建
• 3.小结
• 参考文献
• 第三章 滇蛙皮肤分泌液中抗菌肽的分离与纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、试剂及仪器
• 1.2 两栖类动物处理和样品收集方法
• 1.3 分离纯化
• 1.4 溶血活性检测
• 1.5 结构研究
• 2 结果与分析
• 2.1 分离纯化
• 2.2 抗菌活性
• 2.3 溶血活性检测
• 2.4 分子量与一级结构
• 3 小结
• 参考文献
• 第四章 滇蛙来源抗感染多肽的分子克隆及进化相关分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、试剂及仪器
• 1.2 分子克隆
• 1.3 多样性筛选
• 1.4 进化分析
• 2 结果与分析
• 2.1 滇蛙皮肤抗感染多肽cDNA序列多样性分析
• 2.2 碱基转换与颠换分析
• 2.3 同义突变与错义突变分析
• 3 小结
• 参考文献
• 第五章 滇蛙来源抗感染多肽的生物学功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 最小抑菌浓度测定
• 1.3 溶血活性检测
• 1.4 肥大细胞脱粒肽活性检测
• 1.5 组胺释放活性检测
• 1.6 红细胞凝集活性检测
• 1.7 抗氯化活性检测
• 1.8 蛋白酶抑制剂活性检测
• 2 结果与分析
• 2.1 抗菌活性检测
• 2.2 溶血活性检测
• 2.3 肥大细胞脱粒肽及组胺释放活性
• 2.4 红细胞凝集活性检测
• 2.5 抗氯化活性检测
• 2.6 蛋白酶抑制剂活性检测
• 3 小结
• 参考文献
• 创新之处
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文以及获得奖项
• 附录
• 附录一、培养基及试剂配方
• 附录二、糖抑制试验糖试剂详单
• 附录三、人工合成抗感染多肽质谱图谱
• 附录四、抗感染多肽合成液相色谱图
• 附录五、获奖证书