云南石仙桃和猴耳环活性成分的研究

论文题目: 云南石仙桃和猴耳环活性成分的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 药物化学

作者: 郭晓宇

导师: 姚新生,王乃利

关键词: 云南石仙桃,猴耳环,茋族类化合物,二苯乙烯,联苄,二氢菲,二氢菲并呋喃类化合物,黄烷,抑制释放活性,抑制剂,细胞毒活性,细胞周期抑制,细胞凋亡,自由基清除活性,氧自由基清除能力,免疫抑制

文献来源: 沈阳药科大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本论文采用抑制RAW264.7大鼠巨噬细胞一氧化氮（NO）释放的体外活性筛选方法，对兰科石仙桃属植物云南石仙桃（Pholidota yunnanensis Rolfe）和含羞草科猴耳环属植物猴耳环（Pithecellobium clypearia Benth.）进行了活性部位筛选，化合物分离以及结构鉴定的工作。利用多种现代色谱手段从云南石仙桃干燥全草60％乙醇提取物中分离得到了40个化合物，通过化学和光谱学（IR，MS，NMR）方法鉴定了它们的结梅，分别为：反式-3，3′-二羟基-2′，4′，5-三甲氧基二苯乙烯（1），反式-3，4′-二羟基-2′，3′，5-三甲氧基二苯乙烯（2），反式-3，3′-二羟基-2′，5-二甲氧基二苯乙烯（3），反式-3-羟基-2′，3′，5-三甲氧基二苯乙烯（4），反式-3，3′，5-三羟基二苯乙烯（5），反式-3，3′，5-三羟基-2′-甲氧基二苯乙烯（6），反式-2′，3，3′-三羟基-5-甲氧基二苯乙烯（7），顺式-3，3′-二羟基-5-甲氧基二苯乙烯（8），3，3′-二羟基-5-甲氧基联苄（9），3，4′-二羟基-3′，5-二甲氧基联苄（10），3，3′，5-三羟基联苄（11），3，3′，α-三羟基-5-甲氧联苄（12），正十九烷酸（13），1，5-二羟基-2，7-二甲氧-9，10-二氢菲（14），4，7-二羟基-2-甲氧基-9，10-二氢菲（15），2，4，7-三羟基-9，10-二氢菲（16），2，7-二羟基-4-甲氧基-9，10-二氢菲（17），2，7-二羟基-6-甲氧基-9，10-二氢-5H-菲-[4，5-bcd]吡喃（18），6-[2′-（3，3″-二羟基-5′-甲氧基联苄基）]-4，7-二羟基-2-甲氧基-9，10-二氢菲（19），6-[6′-（反式-3′，3″-二羟基-5′-甲氧基二苯乙烯基）]-4，7-二羟基-2-甲氧基-9，10-二氢菲（20），1-[2′-（反式-3′，3″-二羟基-5′-甲氧基二苯乙烯基）]-4，7-二羟基-2-甲氧基-9，10-二氢菲（21），4，4′，7，7′-四羟基-2，2′-二甲氧基-9，9′，10，10′-四氢-1，1′-二菲（22），4，4′，7，7′-四羟基-2，2′-二甲氧基-9，9′，10，10′-四氢-1，6′-二菲（23），1-[（9，10-二氢-4-羟基-2-甲氧基-7-菲基）氧基]-4，7-二羟基-2-甲氧基-9，10-二氢菲（24），7-O-[6′-（3″，4′-二羟基-5′-甲氧基联苄基）]-4-羟基-2-甲氧基-9，10-二氢菲（25），2-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-3-乙酰氧基甲基-7-甲氧基-2，3，9，10-四氢-菲并[2，3-b]呋喃-5-醇（26），2-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-3-羟甲基-7-甲氧基-2，3，9，10-四氢-菲并[2，3-b]呋喃-5-醇（27），2-（4-羟基-3，5-二甲氧基苯基）-3-羟甲基-8-甲氧基-2，3，10，11-四氢-菲并[1，2-b]呋喃-5，6-二醇（28），4，5-氧撑-2-（4-羟基-3，5-二甲氧基苯基）-3-羟甲基-1-甲氧基-2，3，9，10-四氢-菲并[2，3-b]呋喃-7-醇（29），4，5-氧撑2-（4-羟基-3，5-二甲氧基苯基）-3-（3-羟基-5-甲氧基苯基）-7-甲氧基-2，3，9，10-四氢-菲并[2，3-b)呋喃-8-醇（30），4′-羟基-3′，7-二甲氧基-5-（3″-羟基苯乙基）黄烷-3-醇（31），4′-羟基-3′，5′，7-三甲氧-5-（3″-羟基苯乙烯基）黄烷-3-醇（32），（±）-松脂素（33），（±）-丁香脂素（34），（±）-lyoniresinol（35），（±）-异落叶松树脂醇（36），（±）-5-甲基-异落叶松树脂醇（37），4-（3-羟基苯基）-2-丁酮（38），4-（3-羟基-2-甲氧基苯基）-2-丁酮（39），（+）-（3R）-Lasiodiplodin（40）。40个化合物中，有8个二苯乙烯类化合物（化合物1—8），4个联苄类化合物（化合物9—12），17个9，10-二氢菲类衍生物（化合物14—30），2个黄烷类化合物（化合物31、32），5个木脂素类化合物（化合物33—37），3个酚酸类化合物（化合物38—40）以及1个脂肪酸类化合物（化合物13）。新化合物共19个，分别为化合物1—4，6—8，19—21，23—30和32；2个（化合物38、39）为首次从植物中分离得到；16个（化合物5、9—16、22、31、33—37）为首次从该属植物中分离得到；2个（化合物17、18）为首次从该种植物中分离得到；并首次报道了9，10-二氢菲并呋喃类化合物的结构及其生物活性。利用抑制大鼠巨噬细胞NO释放的活性测试方法，对40个化合物进行了活性评价，发现二苯乙烯类、联苄类、9，10-二氢菲类以及9，10-二氢菲并呋喃类化合物显示出了很强的NO释放抑制作用，并具有初步的构效关系。其中化合物2对由脂多糖（LPS）和干扰素-γ（INF-γ）诱导的RAW264.7大鼠巨噬细胞iNOS mRNA的表达具有抑制作用，说明化合物2对NO释放的抑制是通过限制iNOS的基因转录而完成的。在NO释放抑制活性的基础上，采用MTT法，测定了单体化合物对NCI推荐的三种人肿瘤细胞NCI-H460（人非小细胞肺癌）、SF-268（人神经胶质瘤）和MCF-7（人乳腺癌），以及HepG2（人肝癌细胞）的细胞毒活性。实验结果表明，部分二苯乙烯类化合物能够选择性地抑制HepG2的生长。化合物2、形成的二聚体的芪族类化合物（stilbenoids）以及9，10-二氢菲并呋喃类化合物，对四种肿瘤细胞都具有生长抑制作用。针对同时具有NO释放抑制活性和细胞毒活性的化合物2进行了较为深入的研究，发现化合物2是通过上调Cyclin B1的表达使得细胞阻滞在G2／M期，并通过下调Bcl2的表达引发细胞凋亡，由于PARP蛋白的裂解可知此凋亡可能经过了Caspase3的通路。针对40个化合物多数具有酚羟基的结构特点，我们还采用了清除1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）自由基的活性测试方法，考察了它们的体外抗氧化能力。结果表明，部分二苯乙烯类化合物以及9，10-二氢菲类衍生物和环木脂素类化合物具有很好的清除DPPH自由基的作用，并具有初步的构效关系。以上结果提示民间用草药云南石仙桃抗炎作用的物质基础可能为二苯乙烯类、联苄类、9，10-二氢菲类以及9，10-二氢菲并呋喃类化合物；抗癌作用的物质基础可能为二苯乙烯类化合物、形成二聚体的芪族类化合物以及9，10-二氢菲并呋喃类化合物；抗氧化作用的物质基础可能为二苯乙烯类化合物、9，10-二氢菲类衍生物以及环木脂素类化合物。其中该植物富含的二苯乙烯类化合物有可能作为iNOS选择性抑制剂，用作预防和治疗炎症、癌症等疾病。本文为今后对该种中草药的开发与利用，提供了详实的理论和实验依据。我们采用抑制大鼠巨噬细胞NO释放的体外活性测试方法，确定含羞草科猴耳环属植物猴耳环（Pithecellobium clypearia Benth．）的60％乙醇提取物具有很强的NO释放抑制活性。利用多种现代色谱手段对其中的乙酸乙酯萃取部分进行了初步的分离，从中分离得到了8个化合物，通过化学和光谱学方法鉴定了它们的结构，分别为：没食子酸（1），没食子酸乙酯（2），（-）-（2R，3R）-表没食子儿茶素（3），（-）-5，7，3′，4′，5′-五羟基黄烷（4），（-）-（2R 3R）-表没食子儿茶素-7-没食子酸酯（5），（-）-5，3′，4′，5′-四羟基黄烷-7-没食子酸酯（6），槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（7），杨梅树皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（8）。8个化合物中，有2个小分子酚酸类化合物（化合物1、2），4个黄烷类化合物（化合物3—6）以及2个黄酮苷类化合物（化合物7、8）。化合物6为新化合物，化合物4为首次从植物中分离得到，化合物2、5和8为首次从该属植物中分离得到，化合物3和7为首次从该种植物中分离得到。我们测试了8个化合物抑制大鼠巨噬细胞NO释放的活性，发现化合物6具有较强的NO释放抑制活性，化合物5和8具有较弱的活性。针对各单体化合物具有多酚羟基的结构特点，我们又采用了DPPH自由基清除能力以及氧自由基清除能力（ORAC）两种活性测试方法，考察了它们的体外抗氧化能力。实验结果表明，8个化合物都具有很强的DPPH自由基清除活性。化合物S、7和8的氧自由基清除能力强于VC。各单体化合物对于不同的自由基表现出了不同的体外抗氧化能力。此外，我们又采用了ConA刺激小鼠脾细胞增殖的模型，以观察猴耳环中各单体化合物对T淋巴细胞增殖和活化的影响。实验结果显示，化合物1、2、4、6和8具有一定抑制T淋巴细胞增殖的活性，而化合物5具有较强的抑制活性。本论文通过对猴耳环活性成分的初步研究发现，该植物中的酚类成分，尤其是黄烷类化合物，具有抑制大鼠巨噬细胞NO释放、清除DPPH自由基和氧自由基以及抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖多种生物活性。由此，我们推测猴耳环的抗炎疗效是该植物中所富含的酚类成分潜在的iNOS选择性抑制、抗氧化以及免疫抑制多种作用的综合体现。在上述工作的基础上，建立了NO释放抑制活性部位乙酸乙酯萃取物的指纹图谱，为进一步提高猴耳环的质量标准奠定了基础。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

缩略语说明

第一章前言

第二章云南石仙桃活性成分的研究

第一节抑制大鼠巨噬细胞NO释放的体外活性筛选模型

1.1 生物学基础

1.2 实验方法的确立

1.2.1 实验原理

1.2.2 细胞的培养以及供试样品的配置

1.2.3 活性的测定方法

第二节云南石仙桃活性成分的分离及结构鉴定

2.1 化学成分的活性追踪分离

2.2 从云南石仙桃中分离得到的化合物的名称、编号和结构

2.3 化合物的结构鉴定

2.3.1 二苯乙烯类化合物的结构解析

2.3.2 联苄类化合物的结构解析

2.3.3 9,10-二氢菲类衍生物的结构解析

2.3.3.1 9,10-二氢菲类化合物的结构解析

2.3.3.2 二聚体的结构解析

2.3.3.3 9,10-二氢菲并呋喃类化合物的结构解析

2.3.4 黄烷类化合物的结构解析

2.3.5 木脂素类化合物的结构解析

2.3.6 酚酸类化合物的结构解析

第三节生物活性研究

3.1 大鼠巨噬细胞NO释放抑制活性

3.1.1 NO释放抑制活性测试

3.1.2 化合物2对iNOS mRNA表达的影响

3.1.3 小结

3.2 体外细胞毒活性

3.2.1 初步细胞毒活性测试

3.2.1.1 MTT方法的原理

3.2.1.2 细胞培养及供试样品的配制

3.2.1.3 活性测试

3.2.2 IC_(50)值的测试

3.2.3 化合物2对HepG2细胞的细胞周期抑制活性

3.2.3.1 实验方法

3.2.3.2 实验结果

3.2.4 化合物2对HepG2细胞的诱导细胞凋亡活性

3.2.4.1 基本原理

3.2.4.2 实验方法及结果

3.2.5 化合物2对HepG2细胞中周期相关蛋白及凋亡相关蛋白的影响

3.2.5.1 实验方法

3.2.5.2 实验结果

3.2.6 小结

3.3 1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(DPPH·)清除活性

3.3.1 基本原理

3.3.2 实验方法及结果

3.3.3 小结

第四节小结与讨论

4.1 小结

4.2 讨论

4.2.1 石仙桃属与石斛属植物化学成分及药理活性初步比较

4.2.2 二苯乙烯、联苄及9,10-二氢菲类化合物波谱学特征的探讨

4.2.3 云南石仙桃中茋族类化合物(stilbenoids)生合成途径的探讨

第三章猴耳环活性成分的研究

第一节猴耳环活性成分的分离及结构鉴定

1.1 化学成分的分离

1.2 从猴耳环中分离得到的化合物的名称、编号和结构

1.3 化合物的结构鉴定

第二节生物活性评价

2.1 大鼠巨噬细胞NO释放抑制活性

2.2 1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(DPPH·)清除活性

2.3 氧自由基清除能力(ORAC)

2.3.1 基本原理

2.3.2 实验方法

2.3.3 实验结果

2.4 抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖活性

2.4.1 基本原理

2.4.2 实验方法

2.4.3 实验结果

第三节活性部位指纹图谱的建立

3.1 实验条件

3.1.1 仪器与试剂

3.1.2 样品配制

3.1.3 色谱条件

3.2 指纹图谱的测定

3.3 小结

第四节小结和讨论

第四章实验部分

第一节实验仪器及材料

1.1 植物材料

1.2 实验用仪器

1.3 实验用材料

第二节结构鉴定数据

2.1 云南石仙桃中化学成分的结构鉴定数据

2 2 猴耳环中化学成分的结构鉴定数据

参考文献

致谢

附录

1.个人简介

2.学术成果

3.附图

3.1 云南石仙桃(Pholidota yunnanensis Rolfe)中化合物的图谱

3.2 猴耳环(Pithecellobium clypearia Benth.)中化合物的图谱

发布时间: 2006-12-14

参考文献

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云南石仙桃和猴耳环活性成分的研究

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