光滑球拟酵母内乙酰CoA水平调控对其碳代谢流的影响

论文摘要

本文以一株能在胞外大量积累丙酮酸和α-酮戊二酸（α-KG）的光滑球拟酵母（Torulopsis glabrata）四重维生素的营养缺陷型菌株WSH-IP303为研究菌株,采用外源添加维生素和乙酸、过量表达acetyl-CoA合成酶和过量表达丙酮酸脱羧酶等三种策略,调节细胞内Acetyl-CoA/CoA比率,使碳代谢流从过量积累丙酮酸转向过量积累α-酮戊二酸。主要研究结果如下:1.随着培养基中唯一碳源乙酸钠浓度的升高,菌体浓度不断升高。当培养基中乙酸钠浓度为6 g/L时,细胞浓度和α-KG浓度（13.5 mmol/L）均达到最大值。此时,胞内acetyl-CoA的浓度为36.63±2.08 nmol/g DCW,Acetyl-CoA/CoA的比率为0.13;继续添加乙酸钠（≥6 g/L）并不能有效提高细胞浓度、acetyl-CoA含量和α-KG的产量;在葡萄糖乙酸混合发酵培养基中添加乙酸钠浓度为6 g/L时,α-KG的产量达到最高值13.35 g/L,胞内Acetyl-CoA为6.09±0.61μmol/ g DCW,Acetyl-CoA/CoA比值达到0.47,此时Cα-KG/CPYR为0.46;通过外源增加VB1和乙酸钠浓度均可以加强acetyl-CoA的合成,胞内acetyl-CoA水平随着培养基中VB1和乙酸钠浓度的增加而增加,同时促进了α-KG的合成。当VB1的浓度为0.015 mg/L时,α-KG的产量最高达13.02 g/L,胞内Acetyl-CoA为6.42μmol /g DCW,Acetyl-CoA/CoA比值达到0.92,Cα-KG/CPYR的值为0.50。2.为了研究acetyl-CoA及其衍生物在细胞内的形式和含量对代谢途径及代谢流量的影响。将来源于酿酒酵母中编码acetyl-CoA合成酶ACS2基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的工业菌株Torulopsis glabrata中,获得了一株acetyl-CoA合成酶活性提高了9.2倍（1.20 U/mg protein）的重组菌T. glabrata ACS2-1。与出发菌株WSH-IP303相比,重组菌T. glabrata ACS2-1:（1）能以乙酸为唯一碳源在胞内积累0.94μmol/g DCW的acetyl-CoA;（2）以葡萄糖为唯一碳源时胞内acetyl-CoA浓度、α-KG产量和Cα-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的3.22、2.05和2.52倍;（3）在葡萄糖培养基中添加4 g/L乙酸,导致acetyl-CoA浓度、α-KG产量和Cα-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的4.55、2.47和3.75倍,α-KG浓度达到17.8 g/L。3.将来源于酿酒酵母中编码丙酮酸脱羧酶PDC1基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的工业菌株Torulopsis glabrata中,获得了一株丙酮酸脱羧酶活性提高了14.2倍（7.22±0.09 U/mg protein-1）的重组菌T. glabrata PDC1-1。在葡萄糖培养基中添加30 g/L丙酮酸时,重组菌T. glabrata PDC1-1与对照菌株T. glabrata::pYES2相比:（1）丙酮酸脱羧酶活性提高了14.16倍（7.22±0.09 U?mg of protein-1）;（2）重组菌株T. glabrata PDC1-1α-KG产量和Cα-KG/Cpyr分别为:38.8 g/L和1.39,分别是对照菌的182%和284% ; （3）重组菌T. glabrata PDC1-1胞内acetyl-CoA节点代谢通量和acetyl-CoA/CoA比对照菌分别提高了2.38倍和3.76倍,达到17.55μmol/g DCW和2.37,而CoA浓度则降低了11.1%;（4） T. glabrata CCTCC M202019是乙酸渗漏缺陷型菌株,其丙酮酸脱羧酶活性组成型降低。在普通发酵培养基中重组菌T. glabrata PDC1-1的PDC1活力是T. glabrata CCTCC M202019菌株的15.63倍,其中α-KG的产量和Cα-KG/Cpyr比值分别是其的4.55倍（31.2 g/L）和7倍（1.68）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 辅因子工程——代谢工程的一个重要分支
• 1.2.1 概述
• 1.2.2 CoA 是重要的辅因子
• 1.2.3 调控微生物胞内CoA 库的策略及应用
• 1.3 α-酮戊二酸
• 1.3.1 α-酮戊二酸的用途
• 1.3.2 发酵法生产α-酮戊二酸
• 1.4 立题意义及研究的主要内容
• 1.4.1 光滑球拟酵母发酵生产α-酮戊二酸时存在的问题
• 1.4.2 本论文的主要研究内容
• 1.4.3 本论文中所用到的符号说明
• 第二章 维生素对光滑球拟酵母胞内CoA 库的调节以及对碳代谢流的影响
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种与材料
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 培养方法
• 2.2.4 分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 乙酸为唯一碳源时乙酸钠浓度对T. GLABRATACOA 库和α-KG 积累的影响
• 2.3.2 添加乙酸钠对T. GLABRATACOA 库和α-KG 积累的影响
• 2.3.3 V81 浓度对T. GLABRATACOA 库和α-KG 积累的影响
• 2.3.4 ACETYL-COA 库对碳代谢流流速度及分布的影响
• 2.4 小结
• 第三章 过量表达AC52 提高T. glabrata 胞内acetyl-CoA 水平促进α-KG 合成
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 培养条件
• 3.2.4 DNA 操作
• 3.2.5 目的片段的PCR 扩增
• 3.2.6 尿嘧啶缺陷型菌株的构建
• 3.2.7 表达载体的构建及鉴定
• 3.2.8 T. glabrata 过量表达AC52 工程菌的构建
• 3.2.9 分析与测定
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 目的基因AC52 扩增与表达质粒的构建
• 3.3.2 过量表达AC52 的T. glabrata 重组菌的筛选
• 3.3.3 过量表达AC52 促进T. glabrata 好氧生长性能
• 3.3.4 增加acetyl-CoA 含量促进α-酮戊二酸合成
• 3.4 小结
• 第四章 过量表达PDC1 提高T. GLABRATA 胞内ACETYL-COA 水平促进α-酮戊二酸合成
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株和质粒
• 4.2.2 DNA 操作
• 4.2.3 目的片段的PCR 扩增
• 4.2.4 表达载体的构建及鉴定
• 4.2.5 T. glabrata 过量表达PDC1 工程菌的构建
• 4.2.6 分析与测定
• 4.2.7 胞内PDC1 酶活力的测定
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 目的基因PDC1 扩增与表达质粒的构建
• 4.3.2 过量表达PDC1 的T. glabrata 重组菌的筛选
• 4.3.3 过量表达PDC1 的T. glabrata 重组菌的发酵特性
• 4.3.4 T. glabrata PDC1-1 利用丙酮酸提高acetyl-CoA 含量促进α-KG 的合成
• 4.4 小结
• 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文